浅析vigs的作用机制

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1、浅析VIGS的作用机制VIGS技术除在烟草（Gossele，等，2002）、番茄（张策等，2007）、豌豆（宋伟杰等，2007）和大豆（吕山花等，2010）等双子叶植物中应用成功外，许多单子叶植物病毒也被改建成载体，以便在单子叶植物中抑制基因表达(Oikaatogoldenmosaicvirus，TGMV)、烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus，TRV)、卫星病毒诱导的沉默系统(satellitevirus-inducedsilencingsystem，SVISS)、甘蓝缩叶病毒(cabbageleafcurlvirus，CbLCV)、玉米条纹病毒(maizestre

2、akvirus，MSV)等(Burch-Smith等2004；王宏芝等，2005；Palmer等，1999)。大麦条纹花叶病毒(Lame等，2003)以及小麦矮缩病毒(as等，2001；JackieCampbell等，2010)。为了使目标基因能够有效的沉默，有人对此研究的结果表明以200~500bp插入片段的沉默效果最佳(Burch-Smith等，2004；Ekengren等，2003；Lu等2003b)。当然，也可能存在其它影响沉默效果的因素，如目标基因序列的核苷酸组成(Thomas等2001)、siRNA及目标序列的碱基对的热力学特性等(Khvorova等2003；Schit

3、h等2004)，其中温度对它们的影响最大。不同的VIGS载体在不同的植物中，引起高效基因沉默的温度也不同。例如，用TRV感染番茄，较好的沉默表型在22℃或更低的温度下发生；而用TRV感染烟草，合适的温度则在25℃左右(Burch-Smith等，2004；Ekengren等，2003；Liu等，2002a；Nethra等，2006)；25℃～29℃是BSMV在大麦上诱导基因沉默的适宜温度。另外，Fu等(2006)发现，低温和低湿的条件可以增强基因沉默的强度和延长沉默的持续时间。据张立荣（2011）等研究小麦VIGSPDS基因沉默效果较适温度在25℃~30℃。Harvinder等（20

4、11）研究显示，在小麦上实施基于BSMV的VIGS实验，最佳的温度条件是白天22℃/夜间18℃。温度的控制可以使用生长箱来完成。VIGS在鉴定功能基因组方面具有诸多优越性。VIGS能够直接在当代植株沉默目的基因，不存在传统方法中的诸多困难，目的基因缺失的表型在当代就能够鉴定出来，这体现了VIGS快速高通量的优点，具有重要意义。另外，VIGS技术还能够实现比对不同品种间的基因沉默，研究基因功能。尽管VIGS具有诸多优越性，但VIGS也存在一些限制。如VIGS有时可能难以完全抑制产生目标基因表达，残量低水平的mRNA仍然有可能支撑靶基因的功能，难以观察到表型变异，其功能也难以确定；经常

5、引起整个侵染植株上靶基因的不一致沉默，在植株间、实验间沉默水平也可能不同；对于单子叶植物农杆菌介导法尚未成功等（姚丹青等，2009）。有些问题随着研究的深入是可以得到解决的，如可利用基因组序列和大量EST数据辅助设计VIGS载体的插入序列。VIGS效果是基于序列同源性，同源性越高，基因沉默效果越好；可通过建立VIGS载体的内部阳性对照，用可见表型标记出沉默的区域等方法来解决。另外，侵染的部位、次数等也可能会影响基因的沉默效果，这方面的研究有待进一步深入。迄今，病毒载体的转染技术还没有形成一套非常成熟有效的方法，已有的报道也只是在少数物种中获得成功，如烟草、番茄、拟南芥等，许多接种条

6、件还需要进一步优化，如感染缓冲液的选择、感染液浓度的确定以及接种方式的优化等。所以，在实际应用中，尤其对于尚无VIGS研究报道的植物，进行前期VIGS体系优化试验对利用该技术手段研究基因在植物中的功能显得更为重要。大麦条斑花叶病毒有3条RNA链：α、β、γ，为短棒状病毒。小麦染病的症状为深绿和浅绿相间的不规则条纹，而早期会出现新叶基部发黄白的条纹，同时伴随株高降低，雌蕊育性降低，种子不饱满等。摩擦发可以使小麦感染BSMV，但在自然界中BSMV主要以侵染种子及花粉传播的方式传播。BSMV病毒可以在单倍体细胞中存活和繁殖。该载体的表达能力是Ti质粒载体的数倍。因其可以寄生Ti质粒不能侵

7、染的单子叶经济作物如大麦、小麦、玉米、水稻等而被研究者选中开发为工程载体。此外BSMV载体拥有较大的基因组，可以容纳较大的外源基因，这也是研究者们所喜爱的一个优点。目前为止，BSMV-VIGS技术在小麦中的应用已经有十年多的时间，BSMV载体主要应用在小麦、大麦、燕麦、野生二粒小麦、簇毛麦、二穗短柄草等禾本科植物。目前研究者们主要是改造BSMV的β，γ分子，其中以改造γ分子的报道居多。Holzberg等改造γb分子，首次实现BSMV-VIGS在大麦上应用，Cheng等