阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β

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1、阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β【摘要】目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β_半乳糖苷酶(β_gal)同源基因，表达β_GAL重组蛋白。方法:从TvcDNA表达文库中分离获得Tv　β_gal同源基因的cDNA克隆，测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE_80L)，转化宿主菌E.coliSG13009，异丙基_β_D_硫代半乳糖苷诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在TvcDNA文库中获得1株2445bp的cDNA克隆。序列分析表明，该序列开

2、放读码框有2415bp，推测肽链具有804个氨基酸,等电点为54；该肽链与多种来源的β_GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277bp片段，构建了pQE_80L/Tv　β_gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82ku。结论:推测该克隆是Tv　β_gal的同源基因，Tv　β_gal基因可以在E.coli中得到表达，为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。【关键词】阴道毛滴虫β_半乳糖苷酶cDNA克隆2HeyuanEntry_ExitInspectionandQuarantineBurea

3、u,Heyuan517000,China)［Abstract］Objective：TocloneandanalyzeTrichomonasvaginalis(Tv)β_galactosidase(Tv_β_gal)homologygene,andtoexpresstherebinantprotEin.Methods：OnecDNAclone,ologyofβ_gal,TvcDNAlibrary.ThecDNAentofthecDNAedbytherebinantplasmid.Theexpressionofproteindode

4、cylsulfate_polya_crylamidegelelectrophoresisanalysisedtodetecttherebinantprotein.Results：OnecDNAcloneeinoacidsequencecontains804residuesanditsisoelectricpointis54.ThecDNAcloneologytotheβ_galhomologusofdifferentspecies.A2277bpfragmentofthecDNAplifiedbyPCRandtherebina

5、ntexpressionplasmid(pQE_80L/Tvβ_gal)olog.Tvβ_galisexpressedonasvaginalis;β_galactosidase;cDNAclone　　β_半乳糖苷酶(β_GAL)，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。早期只是利用该酶水解乳糖的性质来降低牛乳中的乳糖含量,改善人类对牛乳乳糖的不耐受反应。随着生物技术的发展，对编码该酶的基因结构有了深入地了解，使得该酶不仅在食品工业中的用途越来越广，而且在生物技术领域(基因工程、酶工程、蛋白工程方面)都发挥着重要作用，并广泛用于化学、

6、医药等领域。近年来，发现了一种在衰老细胞中表达的β_GAL，而休眠和终末分化的细胞及永生化细胞缺乏或不表达。大多数细胞表达溶酶体β_GAL，在pH=4时具有活性［1］，而衰老细胞中表达的β_GAL在pH=6时活性最高，所以该酶可以作为体内鉴别衰老细胞的生物学标志而被广泛应用［2］。本研究以单细胞真核原生生物阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis，Tv)为模式生物，拟观察β_GAL的表达水平是否也能反映单细胞原生生物的衰老变化。初步报道Tvβ_gal基因的克隆、序列分析和重组蛋白的表达及鉴定。1材料与方法11细胞株

7、及其培养TvLX006细胞株(本实验室保存)取自汕头大学医学院第一附属医院患者。细胞株于改良的TYM(tryptone/yeastextract/maltose)［3］培养基中(去除其中的麦芽糖成分，增加体积分数10%的小牛血清和质量分数1%的葡萄糖)37℃恒温传代培养至对数生长晚期［约48h，细胞数(4～8)×106个/mL］离心收集细胞(2500r/min，10min);用磷酸盐缓冲液(01mol/L，pH　72)洗涤2遍后，提取总RNA和基因组DNA。12Tvβ_galcDNA克隆我室已构建Tv的cDNA文库［4］，

8、在分离cDNA克隆和测序的过程中，获得1个与β_gal及其同源基因有较高同源性的cDNA克隆，命名为Tvβ_gal(GenBankaccessionnumber:EF107527)。13Tvβ_gal基因组DNA及cDNA克隆及鉴定以标准方法［5］提取Tv细胞