复方肝毒清对乙型肝炎病毒的体内外抑制作用论文

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1、复方肝毒清对乙型肝炎病毒的体内外抑制作用论文何金洋，郭兴伯，朱宇同，李向阳，周红燕【关键词】复方肝毒清摘要：【目的】观察复方肝毒清的体内外抗乙肝病毒作用。【方法】体内实验采用先天感染鸭乙肝模型，检测用药前后鸭血清乙肝病毒脱氧核糖核酸(DHBVDNA)的动态变化；体外实验采用2215细胞为模型，检测用药后复方肝毒清对细胞培养上清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用。【结果】体内实验：给药第10天时血清DHBVDNA滴度显著下降(与模型组比较Ｐ＜001)，而停药第3天

2、后又有回升.freelg/LG418、10５?U/L青霉素、100?mg/L链霉素，50?g/LNaHCO３调pH值至70。14鸭血中DHBV检测及分组将动物购回后适应性喂养2?d后，自胫静脉采血，离心，收集血清。提取含有DHBV全基因序列的质粒DNA，按缺口翻译试剂盒操作说明书，用３２P标记作探针，将40?μL血清点于硝酸纤维膜上，然后杂交，放射自显影，筛选出先天自然感染鸭后进行下一步实验。将先天感染鸭分为复方肝毒清组、ACV组和模型组，复方肝毒清组8只，ACV组和模型组均为5只。分别于给药前1?

3、d、给药后5?d、给药后10?d、停药后3?d采血，如上法进行点膜杂交，放射自显影，然后在酶标仪上检测光密度D值(450?nm)，以Ｄ值间接代表病毒载量，用t检验进行统计分析。15细胞毒性检测根据Mosmann等［１］建立的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测药物细胞毒性。具体方法是：向吸去上清的细胞孔中加入含04?g/LMTT的无血清培养液01?mL/孔，37?℃孵育4?h，去上清，用二甲基亚砜溶解，测570?nm波长下的光密度D值，破坏百分率pdistroy＝(Ｄ细胞组-Ｄ实验组）／（

4、Ｄ实验组-Ｄ空白组）×１００，50%毒性浓度(TC５０)是实验孔存活细胞为对照孔50%时的药物浓度。16HBsAg、HBeAg的检测采用华美生物工程公司生产的酶联免疫试剂盒进行检测。药物对抗原的抑制百分率pinhibitory＝（Ｄ细胞组-Ｄ实验组）/（Ｄ实验组-Ｄ空白组）×１００（Ｄ为570?nm下用酶标仪检测到的光密度)；50%抑制浓度(IC50)为HBsAg或HBeAg在抑制率为50%时的药物浓度。治疗指数pＴＩ＝ρＴＣ５０／pＩＣ５０。17给药方法在体内实验中，将复方肝毒清提取物按20?gk

5、g－１d－１灌胃；ACV按200?mgkg－１d－１灌胃，共灌胃10?d；在体外实验中，将复方肝毒清提取物稀释为100、50、25、125、625、312、156、078?mg/mL8个浓度分别给药。18细胞培养方法消化2215细胞，配制成1×１０８/L接种96孔细胞培养板，每孔100?μL，37?℃体积分数为5%的ＣＯ２培养24?h，细胞长成单层后进行实验。将含各浓度药物的培养基加入96孔板，每浓度4孔，每4?d换含同浓度药物的培养液1次，同时设无药物细胞对照组，给药8?d后进行检测。2实验结果2

6、1体内实验表1结果显示，复方肝毒清组在给药第5天起，血清病毒滴度即下降，与模型组比较Ｐ＜005；在给药10?d时血清病毒滴度显著下降，与模型组比较，Ｐ＜001；在停药后3?d，复方肝毒清组血清病毒滴度又有回升，但与模型组比较，仍Ｐ＜001。表明复方肝毒清在给药5?d和10?d时在体内均有抑制DHBV作用，但停药后出现反跳现象。ACV组在给药5?d和给药10?d时血清病毒滴度均有下降，与模型组比较均Ｐ＜001；但停药3?d时又回升，显示ACV在体内的抗DHBV作用比复方肝毒清强而迅速，但停药后反跳也比

7、复方肝毒清明显。表1复方肝毒清对先天感染鸭乙肝模型血清病毒滴度的抑制作用（略）22体外实验见表2、表3。表2结果显示，复方肝毒清在所稀释的各浓度下对HBsAg和HBeAg均有一定的抑制作用，其半数有效浓度(IC50)分别为110?g/L和215?g/L。本实验通过MTT法检测肝毒清对2215细胞的毒性，并计算出治疗指数来评价药物的临床应用前景，其中pTI＞2为有效低毒，2＞pTI＞1为低效有毒，pTI＜1为毒性作用。复方肝毒清对HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为6681和3418，远远大于2，说

8、明复方肝毒清对HBsAg和HBeAg的分泌均有抑制作用且毒性低。表2药物对2215细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用（略）表3肝毒清对HBsAg和HBeAg的抑制作用及细胞毒性（略）3讨论抗HBV治疗仍然是当今乙型肝炎治疗的关键［２］，在临床中最常用的抗HBV药物有两类，即核苷类似物和干扰素类。其中拉米呋啶被认为具有较好的抗HBV作用，但其不能完全清除HBV，停药后易出现病毒反跳，且随着越来越多的应用，发现对拉米呋啶耐药的HBV毒株越来越多［３］。干扰素也具有一