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1、中药心复康在大鼠急性心肌梗塞后对移植骨髓间充质干细胞的保护作用作者：李广斌，苏金玲，姜希娟，范英昌【摘要】目的探讨中药心复康在大鼠急性心肌梗塞后对移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）的保护作用及其机制。方法经密度梯度离心联合贴壁筛选法培养并纯化BMSCs，采用冠状动脉结扎法建立大鼠急性心肌梗塞模型，移植前以5-溴脱氧尿核苷（Brdu）对移植细胞进行标记，术后采用中药心复康灌胃联合干细胞移植治疗。移植后2周ELISA法检测大鼠血清血管内皮生长因子（VEGF）含量；处死动物，免疫组织化学方法检测心肌损伤区V
2、EGF蛋白表达情况、Brdu阳性移植细胞数和CD34+新生血管数。结果心复康联合干细胞移植治疗大鼠心肌梗塞，能提高移植细胞存活率（与细胞移植组比较P<0.05），提高大鼠血清VEGF含量（与细胞移植组比较P<0.05），提高梗塞区VEGF蛋白表达，增加梗塞区新生血管数量。结论中药心复康对大鼠急性心肌梗塞后移植干细胞有明显的保护作用，其机制可能与心复康联合干细胞移植能更有效地促进损伤区血管新生有关。【关键词】心复康；心肌梗塞；骨髓间充质干细胞；血管新生 Abstract：Objective
3、TodiscusstheprotectiveactionontransplantedBMSCsbyChinesetraditionalmedicineXinFuKang(XFK)afterratsacutemyocardialinfarction.MethodsBMSCsethod.TheratsyocardialinfarctionethodeeasuredserumVEGFbymethodofELISA,thealbumenVEGF,cellamountofBrdu(+)andneonatalve
4、sselsofCD34+aroundtheinfarctareabymethodofIHC.ResultsThemethodofXFKbiningBMSCstransplantationincreasedlivabilityoftransplantedBMSCsandserumVEGF(paredenVEGFandneonatalvessels.ConclusionparedplyBMSCstransplantation,XFKhasebetterprotectiononthetransplanted
5、BMSCs.ThemechanismmaybeXFKcanpromotethevesselsregenerationofinfarctarea. Keya公司)，CD44、CD34免疫组化试剂盒（天津联星试剂公司），BrdU石蜡切片免疫组化试剂盒（天津市灏阳生物制品有限公司），VEGF免疫试剂盒及ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），中药心复康（天津中医药大学第一附属医院制剂室）。 2方法 2.1BMSCs体外分离培养和BrdU标记本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选法培养并纯化BMSCs
6、，大鼠脱颈处死,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,适量D-Hank's液冲洗骨髓,100目筛网过滤,采用Percoll分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液,1800r/min离心20min,收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次,800r/min离心5min。以3.0×105/cm2的密度接种于L-DMEM完全培养液,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中继续培
7、养,48h后首次换液,以后每隔3d更换1次培养液,2周后细胞长满80%瓶底。 骨髓间充质干细胞的传代培养:将原代细胞瓶内的培养液弃去,D-Hank's液冲洗2次,以去除培养液中的血清,加入2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸消化细胞,显微镜下观察,控制消化时间。细胞收缩变圆时,立即加入含少量血清的培养液终止消化,用弯头吸管轻轻吹打细胞,收集细胞悬液,800r/min离心5min,弃上清。加入完全培养液充分吹打成单细胞悬液,按1∶3传代接种于75cm2培养瓶内,待细胞铺满瓶底后依上法传代。
8、 骨髓间充质干细胞的鉴定:选用生长状况良好的骨髓间充质干细胞,采用SABC法检测细胞表面抗原CD44+、CD34-的细胞即为所需细胞，实验发现第3代获得BMSCs的纯度超过95%［3，4］，实验用第3代细胞。BrdU标记：每日观察原代及传代的细胞生长状况,需加BrdU的培养瓶中预先加入0.5cm×1.0cm无菌玻片,当细胞铺满瓶底50%时加入BrdU溶液10μmol/L(BrdU50mg;二甲基亚砜0.8ml;水1.2ml)分别孵育24，48，72，96
