外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响

《外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响【摘要】目的研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响。方法将40只大鼠随机分为4组：正常对照组、长期大量吸烟组、短期大量吸烟组、吸烟+bFGF组（吸烟最后15d经腹腔内注射bFGF）。采用线栓大脑中动脉法建立大鼠脑梗死模型。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL法）及免疫组化法检测细胞凋亡和p53蛋白表达。结果各吸烟组脑细胞凋亡及p53蛋白表达较对照组明显增加(P＜0.01)，凋亡细胞数量和p53蛋白表强度随吸烟时间和剂量增加而增加(P＜0.01

2、)。bFGF治疗组大鼠脑细胞凋亡数及p53蛋白表达较单纯吸烟组明显减少(P＜0.01)。结论吸烟可使大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达增加，p53介导吸烟诱导的细胞凋亡，细胞凋亡及p53蛋白表达强度与吸烟时间及数量相关，bFGF通过抑制p53表达减少细胞凋亡。【关键词】外源性碱性成纤维细胞生长因子；吸烟；凋亡；p53；脑细胞凋亡与缺血性脑损伤密切相关。近年来研究发现，吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡，。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是很有临床应用价值的一种神经营养因子，其神经活性广泛，能保护神经元，促进神经生长，具有抗缺血性脑损伤的作用。目前国内外尚无关于外源性bFGF对吸烟所

3、致脑细胞凋亡影响的报道。本实验将外源性bFGF应用于吸烟大鼠，通过对大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达进行比较，探讨外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡的作用及其机制，为临床应用bFGF提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1动物吸烟模型的建立及分组健康成年雄性g/支的市售某品牌香烟，置于80cm×60cm×40cm大小的自制烟熏箱中，实验期间各组大鼠饲养条件一致。　　1.2标本制备各组大鼠用10%水合氯醛麻醉后，开胸经心腔快速灌注肝素化生理盐水250ml，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液（4℃，0.1mol/LPBS配置，pH7.4），灌注固定30min。断头取脑，置于4℃相同浓度的多聚甲醛

4、缓冲液中固定过夜，常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚约5μm。相邻切片分别行TUNEL及免疫组化染色。　　1.3TUNEL法检测细胞凋亡凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物试剂公司。切片依次经二甲苯脱蜡，剃度酒精水化，蛋白酶K20μg/ml37℃消化15min，TBS（pH7.4）洗5min，3次。滴加TUNEL反应液（TdT1μl，DIGdUTP1μl，18μl标记缓冲液，20μl/片），37℃孵育2h。TBS洗2min，3次;加生牡素化地高辛抗体，37℃孵育30min，TBS洗2min，3次;DAB显色，苏木素复染。TBS洗。树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中去掉了TdT酶，

5、其余操作同上。　　1.4免疫组化染色p53多克隆抗体购自武汉博士德生物试剂公司。切片常规脱蜡入水。0.3%过氧化氢37℃作用10min灭活内源性酶。0.01mol/L柠檬酸缓冲液（pH6.0）高压修复2min左右，冷却至室温，滴加5%BSA封闭液37℃，20min。加p53抗体，4℃过夜。PBS洗5min，3次;加生物素化羊抗兔IgG37℃孵育20min，PBS洗2min，3次。滴加SABC37℃，20min。PBS洗3min，5次。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余操作同上。　　1.5图像分析与数据处理用显微成像系统采

6、集图片，计算并分析阳性细胞平均灰度值，数据用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，各组间比较用两样本均数比较的t检验。　　2结果　　2.1大鼠脑细胞凋亡见表1。镜下凋亡细胞TUNEL阳性染色为褐色圆形或椭圆形实心小体。正常对照组偶有散在的凋亡细胞。各吸烟组与正常对照组相比，凋亡细胞明显增多（P＜0.01）。长期大量吸烟组凋亡细胞较短期大量吸烟组明显增多（P＜0.01）。bFGF治疗组凋亡细胞较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多（P＜0.01）。凋亡细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见到。　　2.2p53蛋白表达见表1。光镜下可见核为蓝色、胞浆为棕色的p53阳性

7、细胞。正常对照组有少量阳性表达，各吸烟组p53阳性细胞较正常对照组明显增多（P＜0.01）。长期大量吸烟组p53表达较短期大量吸烟组明显增多（P＜0.01）。bFGF治疗组p53表达较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多（P＜0.01）。p53阳性细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见到，与凋亡细胞分布一致。　　表1吸烟大鼠脑内凋亡细胞及p53阳性细胞平均灰度（略）　　与正常对照组比较：1)P＜0.01，与长期大量吸烟组比较：2)P＜0.01　　3讨论　　吸烟是缺血