肾癌g250抗原蛋白多糖（pg）区蛋白cdna的克隆和序列测定论文

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1、肾癌G250抗原蛋白多糖（PG）区蛋白cDNA的克隆和序列测定论文.freelentofUrology，AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou，Jiangsu221002，China）Abstract:ObjectiveToobtainthecDNAofproteoglycan（PG）regionproteinofG250antigentogetreadyforpreparingthehybridomaandmonoclonalantibodyofG250antigen.MethodsThetotalRNAhumanrenalcarci

2、nomacellline786-0andtheintactcDNAofPGregionproteinplifiedbyRT-PCR.ThecDNAedintoE.coliJM109.ResultsThesequencedeterminedega公司;人肾癌透明细胞株786-0、E.coli菌株JM109和质粒pCA13为本室保存。1.2总RNA提取取786-0细胞1×105，按试剂盒说明提取总RNA。总RNA沉淀溶于100μl无核酸酶的水中，-80℃保存。1.3引物的设计与合成根据发表的人肾癌G250抗原cDNA序列，设计PCR引物。上游引物:5′-ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGA

3、TGCAGGAG-3′，引入了1个HindⅢ酶切位点。下游引物:5′-CCAC-CGCTCGAGTGAAGCGGCCCGCGCAG-3′，引入了1个XhoⅠ酶切位点（加下划线处为酶切位点）。引物由Invitrogen公司合成。1.4RT-PCR加入总RNA20μg作为模板，上、下游引物至终浓度1μmol.L，用Promega公司的RT-PCR系统进行反转录及PCR扩增。反应条件为:94℃30s，60℃1min，68℃2min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。1.5cDNA的克隆及扩增PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和XhoⅠ双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用酚-

4、氯仿抽提纯化。然后与相同酶切并经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化的pCA13质粒室温连接5h，用连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，氨苄青霉素平板筛选，37℃培养过夜。利用pCA13中的抗氨苄青霉素基因，筛选出阳性菌落，挑取单克隆菌落，在LB培养基中小量扩增，按Promega公司的试剂盒说明书提取质粒，酶切鉴定。1.6G250抗原PG区蛋白cDNA序列分析由上海基康生物技术有限公司进行测序。2结果2.1G250抗原PG区蛋白的RT-PCR产物分析将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一清晰特异扩增带，约360bp，其大小与理论预期值一致（图1）。2.2G250抗原PG区蛋白的cDNA克隆与鉴定

5、RT-PCR产物经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后，与相同酶切的PCA13连接，转化E.coliJM109，经氨苄青霉素平板筛选得到阳性克隆，提取质粒后再经HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定，可见约6.9kb的载体片段及360bp的插入片段（图1）。图1电泳分析RT-PCR扩增的产物和PCA13-PG质粒限制性酶切图谱（略）1.PCA13-PG质粒双限制性酶切图谱2.PCA13质粒单限制性酶切图谱3.1kbDNAladder4.电泳分析RT-PCR扩增的产物2.3G250抗原PG区序列分析对经酶切鉴定初步确认的阳性克隆测序。结果显示其序列与Gen-Bank发表的肾癌G250抗原PG区蛋白cDNA序列

6、完全一致。3讨论免疫组化研究表明，85%以上的原发性肾癌和转移性肾癌表达G250抗原，而占肾癌90%的透明细胞癌几乎全部表达此抗原［1］489-494;另外，宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、食管癌、膀胱癌及正常的消化道黏膜细胞和大胆管［1］489-494上也有G250抗原的表达，而包括正常的肾组织在内的其他组织则不表达G250抗原。因此G250抗原可成为肾癌的特异性抗原［2］。国外利用131I标记G250-McAb定位肾转移癌，结果90%以上的转移癌，包括肝、肺、骨及淋巴结转移均被发现，有些仅8mm没有被CT及MRI发现的肿瘤亦被显示［3］。MemorialSloan-Kettering癌症研究

7、［4］中心进行131I-mAbG250治疗肾癌的Ⅰ.Ⅱ期临床试验发现，33例中17例治疗后病情稳定，2例出现肿瘤消减。因此G250抗体在肾癌诊断及治疗中的应用具有远大前景。G250抗原是碳酸酐酶Ⅳ蛋白，位于细胞膜上，是一种跨膜糖蛋白，由459个氨基酸构成。其中38个氨基酸（AA1-37）构成N端信号肽（SP），377个氨基酸（AA38-414）构成胞外区，20个氨基酸（AA415-434）构成跨膜区，25个氨