液相色谱使用及维护相关知识

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1、液相色谱使用及维护相关知识HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成.有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、柱温控制器等。一、输液泵1.泵的构造及原理目前高效液相输液泵多用柱塞往复泵，一般都采用双泵补偿法。如图所示：泵1的缸体容量是泵2的两倍，两者的柱塞运动方向相反。泵1吸液时，泵2排液；泵1排液时，泵2吸取泵1输出量的1/2，这样往复运动，保证输液的连续性。2.泵的使用及维护注意事项泵使用时要注意：a.防止固体微粒进入泵体，泵的入口都连接有砂滤片（或棒），滤器要经常清洗或更换。b.流动

2、相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，会增加泵头内的宝石活塞杆和活塞的磨损。c.泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。d.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。泵的一般故障排除：a.没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵

3、在较大流量（如3ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。   b.压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。二．进样器HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。1．隔膜进样。用微量注射器将样

4、品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1~2%。2．停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现"鬼峰"；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。3．阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀 。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样

5、时，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。②用完全装液法进样时，进样量一般定量环体积的3~5倍，这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。六通阀使用和维护：①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能

6、溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。三.色谱柱柱的使用和维护:   ①　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行。   ②　应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂直接改变为水相。   ③　一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。   ④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面

7、连接一预柱，分析柱与预柱填料相似。   ⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积至少应是柱体积的5倍以上。四.检测器UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，主要性能指标:1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响。2）

8、灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。3）检测限.检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。检测器的故障及排除1）流动池内