cyr61-ccn1在肝细胞肝癌中的原位表达及其临床意义

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1、CYR61/CCN1在肝细胞肝癌中的原位表达及其临床意义丁伟，司维柯，杨景，孙世俊，巫猛，潘静，赵宸【摘要】目的：观察Cyr61在肝细胞肝癌中表达的意义.方法：采用免疫组化法和RT?PCR共检测65例肝细胞肝癌中Cyr61蛋白和mRNA表达水平，分析其表达与肝癌的临床病理学特征的关系.结果：高分化HCC组织的Cyr61蛋白表达水平高于低分化HCC组织(P<0.01)；镜下存在静脉浸润、多结节的HCC组织中Cyr61蛋白表达高于无静脉浸润、单结节的HCC组织(P<0.05).30例肝癌组织Cyr61mRNA表达均为阳性，86.67％（2

2、6/30）癌组织Cyr61mRNA表达低于相应癌旁组织（P<0.05）.结论：Cyr61可能在肝癌的发生早期发挥重要作用，并与肝癌进程中的间质重建和侵袭转移有关.【关键词】癌，肝细胞；Cyr61/C1；免疫组织化学；逆转录聚合酶链反应0引言富含半胱氨酸61(Cyr61/C1)是C家族成员之一，为即刻早期基因，广泛存在于人类多种组织器官,如胎盘、心肌、肺、脑、胰腺和结缔组织等,而在胃肠道、前列腺、肝脏、肾脏中其表达相对较低［1］，是重要的细胞基质调节因子.近来研究发现Cyr61与肿瘤的发生相关，但确切关系和机制尚待阐明.我们采用免疫组化和RT

3、?PCR方法，分析Cyr61在肝细胞肝癌（HCC）和癌旁组织中的表达，并探讨Cyr61与肝癌发生的关系.1材料和方法1.1材料2003?12/2005?09HCC石蜡切片35（男30，女5）例；年龄28~73（平均49.8）岁.其中高分化22例，低分化13例；结节型肝癌22例中，单结节8例，多结节14例；有镜下静脉浸润15例，无20例.存在镜下癌栓14例，无21例.手术切除并经病理确诊的标本30例，男25例，女5例；年龄24~72（平均48.8）岁.取肿瘤及癌旁肝组织，标本离体后迅速置于液氮中保存.Cyr61多克隆抗体购自SantaCruz公司，

4、免疫组化试剂盒SP?9001/9002为北京中杉公司产品.RNA抽提试剂Tripure为Gibco公司产品，逆转录系统试剂Revertra购自Toyobo公司，Cyr61，GAPDH引物均由Invitrogen公司合成，焦碳酸二乙脂(DEPC)为Sigma公司产品，2xTaqPCRMasterMix12.5μL购自天根生物.1.2方法1.2.1Cyr61蛋白检测采用免疫组化SP法.Cyr61工作液由PBS1∶100稀释.用0.01μmol/L枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)热修复方法进行抗原修复.阴性对照以PBS代替一抗.山羊链霉素抗生物素?过氧化酶

5、连接法(SP)试剂盒检测，二氨基联苯胺(DAB)显色.组织结构及背景清晰，所测组织中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性（+），不着色者为阴性(-).定量测定用NIS?Elements图像分析系统检测所有Cyr61阳性切片，每张切片选取5个视野(×400)，且所选区域可以代表整张切片的阳性程度，图像分析系统扫瞄阳性目标1000个/视野以上，测定其阳性细胞的平均吸光度值（MD）代表Cyr61的含量.1.2.2Cyr61mRNA检测采用RT?PCR技术，以GAPDH为内参照.取组织100mg匀浆后用Tripure提取液提取总RNA.取部分总RNA用17g/L

6、的琼脂糖凝胶电泳检查其提取效果，用紫外分光光度计测定260nm和280nm的A值，取A260/A280比值为1.8~2.0者用于RT反应.逆转录合成cDNA.Revertra逆转录系统，根据说明书加入组织总RNA1μL建立20μL反应体系，PCR扩增.Cyr61的上游引物:5′?ACTTCATGGTCCCAGTGCGC?3′，下游引物:5′?AAATCCGGGTTTCTTTCACA?3′，产物大小为106bp，GAPDH上游引物为:5′?CATCACCATCTTCCAGGAGCG?3′，下游引物:5′?TGACCTTGCCCACAGCCTTG?3

7、′产物大小为443bp.反应体系25μL，包括：灭菌蒸馏水9.5μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，样品cDNA1μL，上、下游引物各1μL，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性45s，58℃45s,72℃45s，进行30个循环后，再72℃延伸7mm.PCR产物在含有0.8μgEB的20g/L琼脂糖凝胶中电泳，以QuantityOne定量分析系统对PCR条带进行分析，Cyr61在肿瘤组织和癌旁组织表达量以相应GAPDH的表达量作为校正，以Cyr61与GAPDH相对光密度的比值为Cyr61在肿瘤组织和癌旁组织的相对表达量.统

8、计学处理:Cyr61表达量以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件对组间均值比较，采用t检验.P<0.05表明差异具有统计学意义