资源描述：
《临床医学论文-CYR61-CCN1在肝细胞肝癌中的原位表达及其临床意义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、临床医学论文-CYR61/CCN1在肝细胞肝癌中的原位表达及其临床意义作者：丁伟，司维柯，杨景，孙世俊，巫猛，潘静，赵宸【摘要】目的：观察Cyr61在肝细胞肝癌中表达的意义.方法：采用免疫组化法和RTPCR共检测65例肝细胞肝癌中Cyr61蛋白和mRNA表达水平，分析其表达与肝癌的临床病理学特征的关系.结果：高分化HCC组织的Cyr61蛋口表达水平高于低分化HCC组织(P<0.01)；镜下存在静脉浸润、多结节的HCC组织中Cyr61蛋门表达高于无静脉浸润、单结节的HCC组织(P<0.05)・30例肝癌组织Cyr61mRNA表达均为阳性，86.67%(26/30)癌组织Cyr61m
2、RNA表达低于相应癌旁组织(P<0・05).结论：Cyr61可能在肝癌的发生早期发挥重要作用，并与肝癌进程)I•的间质重建和侵袭转移有关.【关键词】癌，肝细胞；Cyr61/CCN1；免疫组织化学；逆转录聚合酶链反应0引言富含半胱氨酸61(Cyr61/CCNl)是CCN家族成员之一，为即刻早期基因，广泛存在于人类多种组织器官，如胎盘、心肌、肺、脑、胰腺和结缔组织等,而在胃肠道、前列腺、肝脏、肾脏中其表达相对较低[1],是重要的细胞基质调节因子.近來研究发现Cyr61与肿瘤的发生相关，但确切关系和机制尚待阐明.我们采用免疫组化和RTPCR方法，分析Cyr61在肝细胞肝癌(HCC)和癌
3、旁组织屮的表达，并•探讨Cyr61与肝癌发生的关系.1材料和方法1.1材料200312/200509HCC石蜡切片35（男30,女5）例；年龄28〜73（平均49.8）岁.其中高分化22例，低分化13例；结节型肝癌22例中,单结节8例，多结节14例；有镜下静脉浸润15例，无20例.存在镜下癌栓14例，无21例.手术切除并经病理确诊的标本30例，男25例，女5例；年龄24〜72（平均48.8）岁.取肿瘤及癌旁肝组织，标本离体后迅速置于液氮屮保存.Cyr61多克隆抗体购自SantaCruz公司，免疫组化试剂盒SP9001/9002为北京屮杉公司产品.RNA抽提试剂Tripure为Gi
4、bco公司产品，逆转录系统试剂Revertra购fiToyobo公司，Cyr6LGAPDH引物均由Invitrogen公司合成，焦碳酸二乙脂（DEPC）为Sigma公司产品,2xTaqPCRMasterMix12.5uL购自天根生物・1.2方法1.2.1Cyr61蛋白检测采用免疫组化SP法.Cyr611作液由PBS1:100稀释.用0.01umol/L枸槪酸钠缓冲液（pH6.0）热修复方法进行抗原修复.阴性对照以PBS代替一抗•山羊链霉素抗生物素过氧化酶连接法（SP）试剂盒检测，二氨基联苯胺（DAB）显色.组织结构及廿景清晰，所测组织中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性（+），不着色者
5、为阴性（・）.定量测定用NISElements图像分析系统检测所有Cyr61阳性切片，每张切片选取5个视野（X400）,且所选区域可以代表整张切片的阳性程度，图像分析系统扫瞄阳性目标1000个/视野以上，测定其阳性细胞的平均吸光度值（MD）代表Cyr61的含量.1.2.2Cyr61mRNA检测采用RTPCR技术，以GAPDH为内参照.取组织100啤匀浆后用Tripure提取液提取总RNA.取部分总RNA用17g/L的琼脂糖凝胶电泳检查其提取效果，用紫外分光光度计测定260nm和280nm的A值,取A260/A280比值为1.8-2.0者用于RT反应.逆转录合成cDNA.Rever
6、tra逆转录系统，根据说明书加入组织总RNA1uL建立20uL反应体系，PCR扩增.Cyr61的上游引物：5’ACTTCATGGTCCCAGTGCGC3，,下游引物：5’AAATCCGGGTTTCTTTCACA3’,产物大小为106bp,GAPDH上游引物为：5’CATCACCATCTTCCAGGAGCGT,下游引物：5，TGACCTTGCCCACAGCCTTG3’产物大小为443bp.反应体系25uL,包括：灭菌蒸憎水9.5uL,2XTaqPCRMasterMix12.5uL,样甜cDNA1uL,.上、下游引物各1uL,反应条件为94°C预变性5min,94°C变性45s,58
7、°C45s,72°C45s,进行30个循环后，再72°C延仲7mm.PCR产物在含冇0.8ugEB的20g/L琼脂糖凝胶屮电泳，以QuantityOne定量分析系统对PCR条带进行分析，Cyr61在肿瘤组织和癌旁组织表达量以相应GAPDH的表达量作为校正，以Cyr61与GAPDH相对光密度的比值为Cyr61在肿瘤组织和癌旁组织的相对表达量.统计学处理：Cyr61表达量以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件对组间均值比较，采用f检验.P<0.05表明差异具有统计学意义.2结果2
