nell1基因直接体内转染修复犬下颌骨的缺损论文

《nell1基因直接体内转染修复犬下颌骨的缺损论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、nell1基因直接体内转染修复犬下颌骨的缺损论文【摘要】目的:探讨含Nell1基因逆转录病毒液与聚羟基丁酸酯(PLGA)生物材料复合后修复犬下颌骨缺损的效果.方法:制备含Nell1真核细胞表达载体的逆转录病毒液PTPLNCX2Nell1.制备比格犬下颌骨15mm×10mm×5mm的箱状缺损模型，修复实验分为2组：PTPLNCX2Nell1+PLGA修复组（实验组），PLGA修复组（对照组）,每组8个样本,分别于术后8，16aI（NeericanTisueCultureCollection)和PLNCX2逆转录病毒载体(C

2、lontech)，黏端连接后提取质粒进行酶切鉴定(SmaI酶切)，筛选出正确插入的重组质粒PLNCX2Nell1.使用脂质体转染PLNCX2Nell1包装细胞PT67，使用G418筛选至阳性克隆形成，将阳性克隆细胞进行扩增，收集培养上清液，命名为PTPLNCX2-Nell1病毒液.1.2.2生物材料的制备聚羟基丁酸酯(PLGA)生物材料由中国科学院化学研究所制备并惠赠.材料呈多孔块状，参数基本如下：孔径为200~300nm，孔隙率大于90％，将生物材料修剪成体积为0.2cm×0.2cm×1.5cm长条状.使用750mL/L

3、乙醇浸泡，无菌0.1mol/LPBS反复冲洗并浸泡后，紫外线下晾干，封装备用.用于骨缺损修复实验前取1mLPLNCX2-Nell1病毒液浸泡生物材料24h.单纯材料修复组用相应细胞培养基浸泡.1.2.3犬下颌骨缺损修复实验动物选择健康比格犬8只，雌雄不拘,体质量13～15kg,年龄1~1.2岁，适应性饲养2m×10mm×5mm的全层箱状缺损，在其中一个植入相应大小的PTPLNCX2Nell1＋PLGA复合材料，另一侧植入单纯PLGA作为对照.实验方法：以846合剂和氯胺酮1∶1混合后，按混合液中846合剂的0.12~0.15m

4、g/kg肌肉注射.用金刚砂切片切开骨皮质，用牙科台式电钻于犬下颌骨下缘中份骨皮质上造成两个长15mm，宽10mm，深5~6mm的箱状缺损，术中应避免伤及下颌神经血管束，保留骨膜，在其中一个缺损内放入相应大小的PTPLNCX2Nell1＋PLGA复合材料，另一缺损植入单纯PLGA，分层缝合创口.术后肌注青霉素80万U，庆大霉素4万U，2次/d，4d，预防感染.术后分笼常规饲养.1.2.4检测方法大体形态观察：术后8，16o后部分自行脱落.未观察到动物机体的明显排斥反应和材料的裸露.2．2大体观察术后8m×10mm×5mm的箱状缺损，

5、根据X线和组织学切片的结果，采用本方法在体内诱导成骨的过程表现为较为典型的软骨内成骨过程.在成骨的早期出现血管组织和软骨细胞，随着时间的推移，软骨细胞团的内部和周边开始出现成骨细胞，并形成少量编织骨结构，进而形成典型的板层骨结构，并有不规则的大量骨髓腔形成，其内可见较多的骨髓细胞.将含nell1基因的逆转录病毒置入骨缺损区后，病毒液感染邻近肌肉组织内的肌细胞和骨缺损两断端骨髓腔内的间充质细胞，使合成表达外源性Nell1，进而诱导周边的间充质细胞分化成软骨细胞，通过软骨内成骨方式形成成熟的骨组织.将nell1基因置入体内可以采用直接

6、注射或与生物材料复合后植入的方法.直接注射的方法简便易行，但考虑到临床实际骨缺损部位大多为疤痕或大量结缔组织填充或包绕，很难完全体现Nell1基因转染的效果.而将Nell1基因与相应的生物材料复合后，通过外科手术的方法清除骨缺损区的疤痕组织再植入，应能取得较好效果，同时生物材料也能为成骨细胞生长及骨组织的新生提供支架作用，更有利于新生骨组织的形成.我们应用的PLGA孔径为200～300pm，孔隙率大于90%，动物体内实验结果表明此种生物材料与PLNCX2–Nell1病毒液复合后能够形成新生骨组织.虽然有报道认为PLGA材料存在一定

7、的无菌性炎症反应问题，但在本实验中仅观察到少量的炎性细胞浸润，对骨组织的新生没有明显影响.从理论上讲，将含有外源Nell1基因的病毒载体直接用于体内局部治疗时有可能出现过量异位成骨或体内致瘤性的问题.逆转录病毒载体虽然具有高效准确地整合到细胞基因组上的优势，但这种整合作用又是随机的，由于病毒的LTR中含有增强子等调控序列，有可能激活原癌基因或阻断肿瘤抑制基因，并且在产生目的病毒(非复制型逆转录病毒)的同时亦有可能产生野生型病毒(可复制型病毒)，导致肿瘤的发生［56］.我们观察到16ationaxillarysuture［J］.Bon

8、e,2006,38(1):48-58.［2］TingK,VastardisH,MullikenJB,.freelanNELL1expressedinunilateralcoronalsynostosis［