p物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究

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1、P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究作者：胡浩霖，石欣，霍明东，高乃荣，范健【摘要】目的:探讨神经激肽1受体(NK1R)拮抗剂对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺损伤的作用，了解ANP时阻断该受体对肺损害是否具有保护作用。方法:90只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组、ANP组和拮抗剂组各30只。正常对照组开腹后只翻动胰腺，ANP组和拮抗剂组胆胰管恒速逆行注射5%牛磺胆酸钠，制成ANP大鼠模型。拮抗剂组在制模成功后经尾静脉注射NK1R拮抗剂spantide(0.00125%

2、)0.5ml。检测不同时间点肺髓过氧化物酶(MPO)活性和肺毛细血管通透性(LCP)的变化。应用免疫组织化学方法进行NK1R的组织学定位。结果:ANP组6h后肺组织MPO活性和LCP即明显高于正常对照组，并且持续升高（P<0.01）。与正常对照组的各个时间点相比，拮抗剂组肺组织MPO活性和LCP没有明显变化（P>0.05）。免疫组化检查显示，NK1R的表达主要位于肺泡隔血管内皮细胞表面及部分肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞表面等处。结论:ANP时，P物质通过与NK1R结合发挥作用，NK1R拮抗

3、剂阻断了P物质的作用路径，对ANP肺损伤起到一定的治疗作用。【关键词】急性坏死性胰腺炎；神经激肽1受体；神经激肽1受体拮抗剂；肺损伤；大鼠　急性坏死性胰腺炎（ANP）是外科重危急症之一，病理演变迅速，病情险恶。ANP时最易受损的靶器官是肺，50%~70%的急性胰腺炎病人肺功能受损，部分发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[1]。因此，防治肺损伤对提高ANP疗效有着重要的意义。ANP并发肺损伤的发病机制尚未完全清楚。近来的研究表明，P物质在炎性疾病中起到重要的作用[23]。P物质与3种G蛋白偶联的

4、神经激肽受体结合，分别为神经激肽1受体(NK1R)、神经激肽2受体(NK2R)和神经激肽3受体(NK3R)。我们以往的研究表明，ANP时肺组织中NK1R的表达水平明显上调，扰乱了神经激肽的作用环节，加剧了ANP时的肺损害[4]。本研究通过制作ANP模型，予NK1R拮抗剂干预，探讨NK1R拮抗剂在ANP肺损伤发病机制中的作用，为ANP肺损伤的防治提供一条可能的途径。　　1材料和方法　　1.1ANP模型制作健康成年SD大鼠90只，体重250～280g。实验前大鼠禁食12～16h，不禁水。

5、2%戊巴比妥钠0.01ml·kg－１腹腔注射麻醉。60只大鼠采用胆胰管内逆行注射5%牛磺胆酸钠(0.1ml·kg－１)建立ANP模型。正常对照组（30只）仅将十二指肠提出切口，轻轻翻动胰腺3次，不注射牛磺胆酸钠，余操作步骤与下述ANP组相同。将已成功制备的ANP模型大鼠随机分为以下两组：（1）ANP组(30只)，制模成功后经尾静脉注射09%生理盐水0.5ml；（2）拮抗剂组(30只)，制模成功后经尾静脉注射NK1R拮抗剂0.00125%spantide(Sigma公司)0.5ml。分别于6、12和

6、24h处死大鼠(各10只)，留取部分肺脏、胰腺和门静脉血标本，立即切成块状并投入液氮，保存于－80℃超低温冰箱中，或经福尔马林固定后脱水包埋、常规切片。　　1.2淀粉酶和肺髓过氧化物酶(MPO)活性的测定血液分离血浆后进行淀粉酶检查(碘淀粉比色法)。肺组织匀浆后超声粉碎成亚细胞成分，肺组织MPO活性测定按照MPO检测试剂盒(Sigma公司)进行。　　1.3肺毛细血管通透性(LCP)的测定采用伊文思蓝浸入法测定各组大鼠的LCP。经尾静脉穿刺注入2%伊文思蓝（1ml·kg－１），15min后处死动物，剖胸

7、后由右心室匀速注入10ml生理盐水冲洗血管内染料，取出肺脏，将肺表面水分吸尽后，于电子天平上称取湿重，放入4ml甲酰胺中，于37℃温箱放置24h，提取组织中染料。过滤后染液用分光光度计于620nm处读取OD值，通过标准曲线计算提取出的染料量，以单位组织中染料提取量反映LCP。伊文思蓝标准曲线的建立方法：分别取0.1%伊文思蓝标准品0、5、15、20、30、40μl，加入4ml甲酰胺中，620nm比色，将数据进行回归分析，得到回归方程：OD=0.011x-0.001，r=0.99。　　1.4免疫组织化学

8、检测分析石蜡切片经过脱蜡至水后，浸泡在TBS缓冲液（10mmol·L－1TrisHCl,0.85%NaCl，0.1%TritonX100，pH7.4）中15min，用稀释度1∶200的羊抗大鼠NK1R多克隆抗体（SantaCruz公司）于4℃湿盒内孵育过夜，二抗为兔抗羊IgG（美国KirdegarrdPerryLaboratories公司），室温下孵育30min，TBS振洗3遍后加链霉亲合素过氧化物酶复合物，室温下孵育30min，滴入新鲜配制的显