pspa免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究论文

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1、PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究论文胥文春，曹炬，许颂霄，罗进勇，朱旦，尹一兵【摘要】目的：获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值.方法：分离培养肺炎链球菌TIGR4，获取其染色体DNA，采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET32(a)内.freeleStarDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自Takara（大连）公司.DNA提取试剂盒为上海华舜公司产品.IPTG，DAB，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)购

2、于Sigma公司.HisTagMcAb，HisBindColumn(NiNTA)柱及HRP标记羊抗鼠IgG为Novagen公司产品.Balb/c小鼠，雌性，6~8周龄，质量18~20g，购于重庆医科大学实验动物中心.1.2方法1.2.1PETPspA表达载体的构建将肺炎链球菌TIGR4在C+Y培养基中增菌到对数生长中后期，提取基因组DNA，以之为模板扩增PspA片段(1329bp).上游引物：5′GGGGTACCATGATTTTAACAAGTCTAGCCAG3′，含KpnI位点；下游引物：5′CGGAATT

3、CTTATTCTTCTTCATCTCCATC3′，含EcoRI位点，由上海生工生物技术公司合成.胶回收PCR产物并与PMD18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，蓝白筛选，PCR、酶切及测序鉴定.将测序正确的克隆载体和PET32(a)表达载体分别用EcoRI，KpnI双酶切，胶回收目的片段，T4DNA连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，双酶切及PCR鉴定.重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3)，于氨苄青霉素平板上筛选.1.2.2PETPspA重组载体的诱导表达将阳性克隆过夜培养，按1∶20接种至含氨

4、苄青霉素的LB培养液中，37℃，250r/min振摇培养，A600nm=0.6~1.0时加IPTG（终浓度为1mmol/L）诱导，37℃振摇1~4h，离心收集诱导菌，SDSPAGE分析目的蛋白表达情况.1.2.3表达产物的纯化及鉴定低温离心收获诱导菌，冰上超声破菌，12000g低温离心1h，收集上清液，同时以相同体积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，行SDSPAGE以明确蛋白是在上清液还是在包涵体.将上清液用0.45μm滤膜过滤后转入镍层析柱内，用含不同浓度咪唑的缓冲液梯度洗脱，测定各洗脱管的A280nm，SDSPAG

5、E监测各阶段目的蛋白情况.收集洗脱蛋白并以PBS透析除盐，Bradford法蛋白定量，冷冻真空干燥，-20℃保存.取诱导的全菌裂解物，经SDSPAGE后用电转仪转膜，以HisTagMcAb（1∶1000稀释）为一抗，羊抗鼠HRPIgG（1∶3000稀释）为二抗，DAB为显色底物做olMicrobiol,2002,45(5):1389-1405.［3］ShaperM,HollingsheadSK,BenjaminolMicro,2003,50(4):1103-1110.［5］BrilesDE,Hollingshea

6、dSK,NaborsGS,etal.Thepotentialforusingproteinvaccinestoprotectagainstotitismediacausedbystreptococcuspneumoniae［J］.Vaccine,2000,19:S87-S95.［6］BarilL,DietemannJ,EssevazRouletM,etal.PneumococcalsurfaceproteinA(PspA)iseffectiveatelicitingTcellmediatedresponsesdu

7、ringinvasivepneumococcaldiseaseinadults［J］.ClinExpImmunol,2006,145(2):277-286.［7］Brooks,McDanielDO,etal.GeicimmunizationainofPspAelicitsprotectiveimmunityagainststreptococcuspneumonaie［J］.InfectImmun,2001,69(9):5456-5463.［9］BogaertD,DeGrootR,HermansPoniaecolon

8、ization:Thekeytopneumococcaldisease［J］.LancetInfectDis,2004,4(3):144-154.