柱层析—分光光度法测定益母草中总黄酮含量论文

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1、柱层析—分光光度法测定益母草中总黄酮含量论文余丹妮，徐德生，冯怡，卫洪昌【摘要】目的建立益母草药材总黄酮含量测定方法，并对药材资源进行初步考察。方法以芦丁为对照品，样品经聚酰胺柱分离纯化，三氯化铝试剂显色后，采用紫外分光光度法在412nm波长处测定总黄酮含量。结果芦丁在4.8～29.0μg/ml范围内与吸光度有良好线性关系.freelethodforthequantitativedeterminationoftotalflavonoidsinHerbaLeonuri,maketheprimeexa

2、minationoftheresources.MethodsThesampleidecolumnforseparationandpurification,andiniumtrichloride,andthen,thecontentofflavoneinthesampleinedatthebyultravioletspectrophotometerl，r=0.9996theaveragerecoveryoftheaddedsampleethodissimpleandaccurate.Itcanbeu

3、sedforthequalitycontrol.KeynchromatogramUVspectrophotometry益母草为唇形科益母草属植物LeonurousheterophyllusS左右，后者在410nm或270nm附近。因益母草药材在500nm处有较多的干扰吸收，且样品溶液中存在的槲皮素、山柰素等黄酮成分，以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色后在500nm处吸收较弱或无吸收［8］，因此，采用亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠做显色剂并不理想。所以选择三氯化铝为显色剂，芦丁为对照品，进行总黄酮含量测定

4、。2.2除杂条件的确定取益母草药材适量，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取至提取液无色，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解为供试品溶液A。药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解为供试品溶液B。将以上样品及相应对照品溶液分别点样于聚酰胺薄膜上，先以水展开，水展开后将薄膜取出晾干，再以不同浓度乙醇展开，展开后的聚酰胺薄膜喷以三氯化铝试液，于365nm紫外灯下观察荧光。薄层色谱图见图1～3。薄层预示说明，聚酰胺吸附可去除叶绿素（供试液A部分）。水洗脱和20%乙醇洗

5、脱可去除具有显色干扰的水溶性成分。70%乙醇洗脱可富集总黄酮。2.3药材总黄酮提取方法的比较分别取药材细粉3g，加入甲醇50ml，以回流（45min），索氏提取（至无色），超声（200in）3种方法进行提取，测定吸光度，计算总黄酮得率。结果提取方式选择回流提取。2.4益母草药材中总黄酮的测定2.4.1对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的芦丁标准品0.0025g置25ml容量瓶中，加60%乙醇溶解定容成0.1mg/ml的溶液，即得。2.4.2供试品溶液的制备取药材细粉3g，精密称定。置圆底烧

6、瓶中，精密加入甲醇60ml，称重，加热回流45min，放冷、静置，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液30ml置蒸发皿中，水浴蒸干。残渣加少量50%乙醇溶解，水浴挥去1/3体积，加蒸馏水至原体积，混悬，将混悬液过聚酰胺柱（80～100目，1g，内径1cm，湿法装柱）。以20ml水冲洗，弃去水液，再以20%乙醇15ml冲洗，并去醇液。最后，以70%乙醇洗脱，检视黄酮类黄色色带的移动，当色带到达下部时收集洗脱液，将洗脱液收集入25ml容量瓶中，收集至近刻度，加50%乙醇定容，摇匀

7、，作为供试品溶液。2.4.3测定波长的选择取对照品及供试品溶液适量，加入0.1mol/LAlCl3溶液1ml显色30min后在200～800nm进行波长扫描，扫描结果见图4。结果表明，芦丁对照品及样品在273nm处均有最大吸收峰，在412nm处，芦丁有最大吸收，样品吸收强却不显示为最大吸收峰。实验中发现，经聚酰胺除杂后273nm处干扰仍然显著。因此选择412nm为测定波长。2.4.4线性关系考察精密吸取上述对照品溶液0，0.5，1，1.5，2，2.5，3ml分别置于10ml量瓶中，加0.1mol/

8、LAlCl3溶液1ml，以60%乙醇定容至刻度，放置25min，以1号样品为空白，412nm处测定吸收值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。计算得回归方程为Y=25.089X+0.0153，r=0.9996，表明对照品在浓度范围4.8～29.0μg/ml与吸光度有良好线性关系。2.4.5精密度实验取一定浓度供试品溶液测定吸光度，连续测定5次，其RSD为0.26%，仪器精密度良好。2.4.6稳定性实验取供试品溶液于室温分别放置5，10，15，20，25，30，35，45，5