散发性帕金森病parkin基因突变检测论文

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1、散发性帕金森病Parkin基因突变检测论文【摘要】目的探讨散发性帕金森病病人Parkin基因的突变情况。方法应用聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCRSSCP),对18例帕金森病病人和20例正常人Parkin基因的第3、4、5、6、7外显子突变情况进行检测分析。结果4例病人有Parkin基因第3外显子点突变，1例病人有Parkin基因第4外显子点突变，2例病人有Parkin基因第5外显子点突变。所有病例均未检测到Parkin基因外显子缺失突变。结论散发性帕金森病病人中存在Parkin基因点突变，Parkin基因点突变可能是散发性帕金森病发病原因之一。【关

2、键词】帕金森病；Parkin基因；点突变帕金森病(PD)是一种由多因素、多个基因相互作用而产生的缓慢进展的神经系统变性疾病。目前人们对其确切的发病机制尚不清楚1，2。在对家族性PD相关基因的研究中已经发现10个染色体位点以孟德尔遗传方式与PD基因连锁。目前，已有αsynuclein基因、Parkin基因、DJ1基因和UCHL1基因被克隆3。其中，人们对Parkin基因的研究最为广泛。1998年，KITADA等4首次发现并克隆了Parkin基因.freelL，EDTA抗凝，使用上海生工生物工程公司基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃冰箱冻存。

3、1.2.2PCR引物的设计参照KITADA等4方法设计Parkin基因第3、4、5、6、7外显子的引物，序列见表1。引物由上海生工生物工程公司合成。1.2.3PCR扩增PCR反应体系含：DNA样品3μL,2mol/LdNTP2.5μL,两条20pmol/L引物各1μL,10×PCR缓冲液2.5μL,TaqDNA聚合酶0.25μL,加去离子双蒸水至25μL。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环，再72℃延伸7min。PCR试剂均购自上海生工生物工程公司。1.2.4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析将PCR产

4、物行20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外线灯下观察确定基因是否有缺失突变。对有外显子缺失的标本,以βactin为内对照,与内对照引物共同扩增,证实缺失。1.2.5SSCP分析将60g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶在150V恒压、20A恒流条件下先行预电泳30min。取PCR产物7μL，加7μL变性液（含有9.8g/L甲酰胺，10mol/LNaOH，20mol/LEDTA，0.50g/L溴酚兰，0.50g/L二甲苯氰），98℃变性10min，冰浴10min后上样，150V恒压、20A恒流条件下电泳2h。取胶，固定、银染、显色后观察结果并拍照。2结果2.1

5、Parkin基因第3～7外显子PCR扩增18例散发性PD病人及20例正常对照者基因组DNAParkin基因第3～7外显子PCR扩增分别获得427、261、227、268和239bp大小的特异性扩增产物，未见Parkin基因外显子的缺失改变。2.2Parkin基因第3～7外显子PCRSSCP检测4例病人第3外显子有单链泳动变位（图1），1例病人第4外显子有单链泳动变位（图2），2例病人第5外显子有单链泳动变位（图3）。3讨论PD按遗传方式可分为家族性与散发性两种，家族性PD约占PD总数的10%～15%，具有明显家族遗传倾向；而散发性PD则占PD的绝大多数，无

6、明显遗传倾向，但表现为某种遗传易感性。早期发现的Parkin基因主要存在于少年型遗传性PD病人中，但最新研究表明，Parkin基因外显子的突变并非少年型PD所特有，无论是家族性还是散发性PD、无论年轻时发病还是年老时发病的病人中均存在不同程度及类型的Parkin基因突变6。这既说明Parkin基因在PD的遗传学机制中起着十分重要的作用，同时又说明PD发病机制具有复杂性。Parkin基因长500kp，包括12个外显子。国外研究显示，外显子3和外显子4缺失最多见，点突变多发生在外显子2、7、9。国内的学者也发现了外显子1～8的突变；其中，外显子缺失者多见于外显子

7、4和7，点突变多见于外显子2和7。LUCKING等7对来自5个国家的12个常染色体隐性遗传的青少年型帕金森综合征（ARJP）家族进行筛查，研究Parkin基因外显子的缺失与表型的关系，认为不同的家系可能有不同的外显子缺失，从而产生不同的表型特征，这与外显子的功能分工有关8。其后，许多学者相继在ARJP家族病人的Parkin基因外显子中发现了诸多点突变，并提出在PD发病机制中点突变比缺失突变的意义更大。王涛等9经测序证实1例早发性PD病人的外显子7中存在一个未曾报道过的新的点突变位点Gly284Arg，并认为Parkin基因点突变也是我国早发性PD病人的致

8、病原因之一。徐严明等10研究推测，Parkin基因外