黑籽重楼种内形态标记和issr标记的遗传分化研究

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1、黑籽重楼种内形态标记和ISSR标记的遗传分化研究作者：陈照，叶睿超，张瑞，李伟阳，王丽【摘要】　　该文对黑籽重楼Paristhibetica种内两变种——黑籽重楼原变种Paristhibeticavar.thibetica与无瓣黑籽重楼Paristhibeticavar.apetala在形态学及ISSR分子标记上的差异进行了研究和比较。形态特征分析表明黑籽重楼原变种与无瓣黑籽重楼在萼片长宽、花药数、花丝长等7个花器官性状方面有显著差异，但通过在主成分分析图上不能明显区分两个变种，两变种总体形态上的分化不明显。ISSR分析上，从100

2、个ISSR引物中筛选出8个引物，在300～1500bp间共扩增出36条带，其中黑籽重楼原变种特征带有5条，无瓣黑籽重楼扩特征带有8条。【关键词】黑籽重楼变种形态差异ISSR　　Abstract:ThemorphologicaldifferentiationanalysisonParisthibeticavar.thibeticaandParisthibeticavar.apetalaorphologicaldifferentiationbeters100ISSRprimers.And36bandsplifiedbyISSR-PCR,

3、ofpleSequenceRepeat，ISSR)是一种基于微卫星序列发展起来的分子标记［7］,具有简便、多态性高,稳定性和重复性好等优点，在分类学、种系发生学、保护生物学和种群遗传学等方面得到迅速应用［6］。　　本实验通过形态差异分析结合数量统计方法对不同生境下黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼的14项形态特征进行测定和分析，观察黑籽重楼的种内形态分化的水平，以达到了解其遗传多样性水平的目的。并采用ISSR分子标记技术对同域生长的黑籽重楼种下的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼进行分子水平的遗传分化的研究，寻找区别两变种的特征带。　　1材料和

4、方法　　1.1材料用于形态分析的黑籽重楼共来自于10个居群，其中黑籽重楼原变种（Paristhibeticavar.thibetica）分别来自于不同的7个居群，无瓣黑籽重楼(Paristhibeticavar.apetala)分别来自于不同的3个居群（见表1）。表1形态分析材料（略）　　用于ISSR分析的黑籽重楼原变种（Paristhibeticavar.thibetica）和无瓣黑籽重楼(Paristhibeticavar.apetala)均采集于四川彭州龙门山（海拔2560m），各变种各取3株，叶片均用硅胶干燥。凭证标本藏于四

5、川大学生命科学学院植物标本室。　　1.2方法　　1.2.1形态指标测量及相关数据分析选取10个居群的黑籽重楼的14个形态学指标进行测定。用SPSS13.0软件计算各形态学指标的平均值（X）、标准差（δ）、单因素方差分析、使用NTSYS-PC2.10进行主成分分析［8］。　　1.2.2基因组DNA提取基因组DNA提取采用CTAB法［9］，提取的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼基因组DNA分别为各变种的3个个体的混合样。通过1%的琼脂糖电泳检测DNA质量，-20℃保存备用。　　1.2.3ISSR-PCR扩增ISSR-PCR扩增体系为20μl

6、的PCR反应液。其中包括:10×buffer2.5μl，Mg2+2μl(2mmol/L)，dNTP2μl(0.12mmol/L)，ISSR引物2μl(1μmol)，Taq酶0.5μl(1.5U)，模板2μl(50～100ng)，超纯水9.5μl。Taq酶，dNTP和均购自Takara公司，ISSR引物序列由从加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供。　　PCR反应程序为94℃5min，1个循环；94℃30s，36℃60s，72℃90s，40个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物以Takara公司100bpDNAladder为分子标记，经1

7、.5%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结束后用EB染色，并用GeneGeniusBioImagingSystem凝胶成像仪上成像观察。　　2结果与分析　　2.1居群间形态变异对于来自于10个居群的黑籽重楼（黑籽重楼原变种7个居群，无瓣黑籽重楼3个居群）的14项形态特征进行统计分析（见表2），7个黑籽重楼原变种在居群间水平上，在除了叶片长、萼片宽的12个性状的差异极显著。3个无瓣黑籽重楼在居群间水平上，叶柄长、花药数、花丝长、花药长、萼片数5个形状的差异显著。表2居群间形态性状的单因素方差分析（略）　　2.2变种间形态差异为探讨变种间的形态差

8、异，采用单因素方差分析对两变种的各形态指标进行了分析（见表3），14个形态特征中，两个变种在花药数、花丝长、花药长、花瓣数、花瓣长5个花器官性状方面的差异达到极显著，在萼片长和宽上有显著差异。表3两变种具有显著性差异的7个形态性状的单