serex 方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用论文

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1、SEREX方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用论文【关键词】SEREX方法骨肉瘤；抗原0引言肿瘤抗原及其编码基因的理论研究和实验技术使肿瘤抗原的筛选和肿瘤免疫的研究进入一个新阶段1。肿瘤抗原的筛选与鉴定是临床特异性免疫治疗的前提和关键,随着对肿瘤生物学和肿瘤免疫学的深入认识,设计了基于体液免疫的重组cDNA文库的血清学分析(serologicalanalysisofrebinantcDNAexpressionlibraries,SEREX)方法,简便易行2。本文对SEREX方法的原理、技术步骤、及其在骨肉瘤肿瘤基因

2、筛选的应用及研究现状作一简要介绍。1SEREX方法原理重组cDNA表达文库的血清学分析最早由Pfreundsch小组建立2。SEREX方法将分子克隆技术和利用患者自体血清对肿瘤细胞的自体分型技术融为一体,不仅可检测抗体反应,而且能在抗原与患者自体血清反应的基础上,直接从分子水平确定具有免疫原性的肿瘤蛋白质(抗原)。此方法的流程主要是以新鲜瘤组织或细胞样本构建cDNA文库并连接入噬菌体表达载体,以重组的噬菌体转染E.coli大肠杆菌,将细菌表达的重组蛋白转移至NC膜上,与稀释后的病人自体血清共孵育,用酶联特异性抗人

3、IgG二抗识别与高滴度血清抗体反应的克隆,阳性克隆随后亚克隆化,.freelRNA的表达,确定肿瘤抗原的组织表达谱。但SEREX方法也不能检测肿瘤表达的所有抗原,如糖基化的抗原决定簇和在细菌中表达时发生构像改变的抗原决定簇可能被漏检。此外,对某些在肿瘤发展的不同阶段表达的抗原,若取新鲜组织标本的时间与该抗原表达的阶段不一致,也将被漏检。尽管如此,SEREX法仍不失为一种有效、方便的鉴定肿瘤抗原的方法。3SEREX方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用和问题根据SEREX技术，廖博等3,5已完成了人骨肉瘤9901及96

4、07细胞cDNA表达文库的构建和鉴定，廖博等在构建人骨肉瘤9901时3，所建文库容量为1.5×106。根据Clare公式4计算所需文库的大小，计算公式是：N＝ln（1－P）/ln（1－1/n）（N为所需克隆数，P为要求的概率，1/n为低丰度mRNA在总mRNA中所占比例。若要99％的概率得到一个低丰度克隆，所要求的文库克隆数为1.7×105。其所建文库保证了低丰度基因的有效克隆.freelplificationofcDNAends,RACE)获取全长cDNA片段,这将有助对阳性cDNA克隆序列的研究分析,判定其为

5、已知基因序列还是未知序列,是野生型还是突变型810。总之,构建一个高质量的cDNA文库,在实际应用中不是一件容易的事情。4.2肿瘤标本来源及筛选血清的选择应用SEREX技术筛选肿瘤抗原,选用新鲜的肿瘤标本还是细胞株构建cDNA文库,以及选用何种来源的抗血清进行筛选是非常重要的。Sahin等2早期利用新鲜肿瘤标本构建cDNA文库,然后用肿瘤病人自体血清筛选,这种方法虽鉴定了许多肿瘤抗原,但仍存在其局限性。为拓宽SEREX技术鉴定肿瘤抗原的范围,许多学者对方法本身进行了必要的改进。利用细胞株而不是新鲜肿瘤标本构建c

6、DNA文库1113,同时除选用自体血清外还利用同种异体血清来筛选cDNA文库9，11，1416。其理论依据为:①细胞株有着相对单一的转录本库,故用细胞株建库较用新鲜肿瘤标本更具代表性。②包含一种或多种已知肿瘤抗原抗体的异体病人血清,可能是一种更为理想的筛选未知抗原的血清来源。此外用细胞株建库还有其他有利的方面如:缺少正常细胞的污染、排除了B淋巴细胞产生的假阳性IgG表达克隆等。Toshiro等13用INFγ转染细胞株以增加其肿瘤抗原的表达,这可能代表了一种SEREX技术未来应用新的思路。4.3抗原的肿瘤相关

7、性应用SEREX技术筛选肿瘤抗原,目的在于发现新的肿瘤标志物并以之作为肿瘤早期免疫学诊断及肿瘤疫苗研制的候选靶位。然而该技术筛选得到的肿瘤抗原并非都是肿瘤相关抗原,因此在研究中除分析抗原的结构和表达外,检测其对大量不同正常人及肿瘤病人的同种异体血清的反应性,评估其是否为肿瘤相关是至关重要的。在确定一种新的抗原是否具有肿瘤特异性免疫原性之前,必须用大量的正常个体及其他疾病病人的血清进行筛选17。此外SEREX技术筛选的肿瘤抗原不一定都可以被肿瘤特异CTL克隆所识别。而一种典型的肿瘤抗原应既可以被SEREX技术筛选得

8、到,同时也可被特异性CTL克隆所识别,因此进一步研究和鉴定肿瘤抗原对CD4＋及CD8＋T细胞的反应性是SEREX技术发展的主要方向之一。Jager等18在转染分析(transfectionarray)和HLA序列检测(HLAmotifanalysis)基础上建立了一种分析CD8＋T细胞对SEREX技术鉴定抗原反应性的研究方法,值得借鉴。5SEREX的发展前景人类骨肉瘤肿瘤