延胡索中去氢紫堇碱对照品的制备及含量测定论文

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1、延胡索中去氢紫堇碱对照品的制备及含量测定论文杨杰白雪肖海涛刘昌福朱洁郝小燕【摘要】目的研究中药延胡索中去氢紫堇碱对照品的制备及含量测定方法。方法采用硅胶柱色谱与半制备高效液相色谱组合分离技术，分离纯化去氢紫堇碱，采用薄层色谱法和高效液相色谱面积归一化法检测纯度，波谱法鉴定其结构，反相高效液相色谱法测定其含量。结果制备的化合物鉴定为去氢紫堇碱，纯度为98.7％；含量测定在0.0763～0.4576μg呈良好线性关系，r=0.9998，平均回收率为104.44%.freel,150mm×7.8mm）；柱温为室温；检测波长345nm；流动相

2、为0.01mol·L-1碳酸氢铵溶液(用浓氨水调pH10.5)－乙腈（83∶17），流速：2.0ml/min。2.2.2分析HPLC色谱条件DiamonsilTMC18柱(5μm,250mm×4.6mm)，柱温30℃；检测波长345nm；流动相为0.03mol/L的磷酸二氢钾缓冲液－乙腈（74∶26），流速1.0ml/min。2.2.3去氢紫堇碱对照品的制备纯化取去氢紫堇碱粗提物1.0g，用10ml甲醇超声溶解，过0.45μm滤膜，备用。吸取1.0ml样品进半制备型高效液相色谱仪，收集保留时间所在的组分，减压回收溶剂，得去氢紫堇碱粉末

3、。加乙醇适量溶解，重结晶，即得。2.3样品纯度检测及结构鉴定2.3.1晶形确定取少许冷冻干燥絮状物于表面皿中,加少量无水乙醇溶解,常温下放置3d,黄色柱状结晶析出。2.3.2薄层色谱检测薄层板：高效薄层层析板(GF254)。3种展开剂系统：以氯仿-甲醇（5∶1）；氯仿-甲醇-醋酸乙酯(8∶1∶1)；乙醚-环己烷-甲醇（5∶3∶1）。点样：在同一板上，按5，10，15，20，25μl不同的浓度点样。展距8cm，定位后经紫外254nm，碘蒸气及碘化铋钾溶液显色检视。结果在薄层色谱同一位置处，均为单一斑点，未见杂质斑点，符合化学品要求。2.

4、3.3紫外检测取去紫堇碱对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描，结果表明最大吸收波长为345nm。因此，确定345nm为测定波长。2.3.4面积归一化法精密称取去氢紫堇碱对照品，用流动相制成浓度为0.13mg·ml-1的样品溶液，照“分析HPLC色谱条件”，进样10μl，样品显示为单峰，用面积归一化法计算含量为98.7％（保留时间为min），符合中药化学对照品含量测定用要求，结果见图1。2.3.5结构鉴定去氢紫堇碱为黄色晶状柱晶（乙醇），熔点135℃。EI-MSm/z:366［M］+1.1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.97(3H,

5、s,CH3-13),3.24(2H,.freell具塞三角瓶中，加入1％的盐酸甲醇20.00ml，称重，40℃超声提取30min，取出，补足减失重量，冷却，滤过，取续滤液10.00ml，回收乙醇，流动相定容至10.00ml，过0.45μm滤膜，备用。2.4.3线性范围考察精密称取去氢紫堇碱对照品0.0153g于20ml容量瓶中，用流动相定容，得去氢紫堇碱储备液。再从中取1.00ml置于10ml容量瓶中，用流动相定容，得浓度为76.5μg·ml-1的对照品标准溶液。分别精密吸取对照品标准溶液1，2，3，4，5，6μl注入色谱仪，记录峰面

6、积。以色谱峰积分面积为纵坐标(Y)，去氢紫堇碱的进样量为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=5457.1042X-17.1221，r=0.9998，样品在0.0763～0.4576μg浓度范围内线性关系良好。2.4.4精密度实验精密吸取同一对照品液3μl，照前述色谱条件重复进样6次，测得去氢紫堇碱峰面积积分值的RSD为0.67%，表明测定仪器精密度良好。2.4.5重复性实验取同一批样品，按“供试品溶液的制备”方法，平行制备供试品溶液6份，按前述色谱条件进样10μl，测得去氢紫堇碱总含量平均值为0.9713mg·g-1，RSD为

7、2.48%，表明测定方法重复性良好。2.4.6稳定性实验将同一份供试品溶液放置0，2，4，8h后，照前述色谱条件进样10μl，测得去氢紫堇碱在8h内峰面积的RSD为1.79%，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。2.4.7回收率实验取已知含量的样品约0.5g，共6份，精密称定，分别加入不同量的去氢紫堇碱对照品，按“供试品溶液的制备”方法制备，按前述色谱条件进样10μl，测得去氢紫堇碱的平均回收率为104.44%，RSD为2.36%（n=6），表明测定方法准确可靠。结果见表1。表1回收率实验3讨论延胡索生物碱类大部分属于小檗碱或原小檗碱型

8、，它们性质相差较小，极性相近，前人对去氢紫堇碱的分离采用的均是常压硅胶柱法，效率较低。本研究通过常规方法分离得到去氢紫堇碱粗品，再用反相高效液相色谱法提纯去氢紫堇碱，方法简便易行，产品纯度好，成本低，适合去氢紫堇碱对照品