p53和血管内皮生成抑素基因共转染对hl60细胞生长的影响

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1、p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响【摘要】目的观察p53和血管内皮生成抑素基因(AS)共转染对HL60细胞生长和血管内皮生长因子(VEGF)、bax、bcl2表达水平的影响,探讨联合基因治疗急性白血病的可能性。方法选用脂质体将p53+AS转染HL60细胞,以RTPCR法检测转染后细胞目的基因的表达。通过细胞集落形成实验、MTT试验及流式细胞仪观察p53+AS转染后对HL60细胞生长的影响。采用RTPCR及免疫组织化学检测p53+AS转染后HL60细胞的VEGF、bcl2与bax表达的改变

2、。结果p53+AS转染成功并在HL60细胞中稳定表达,明显抑制细胞的生长,协同促进凋亡,使细胞的VEGF和bcl2表达下降,bax表达升高。结论p53+AS转染对HL60细胞生长具有明显的抑制作用,两者存在协同效应,其机制可能是影响bcl2/bax。【关键词】基因；p53;血管抑制素类;白血病;HL60细胞;细胞凋亡基因疗法是近年来肿瘤治疗的热点,但效果不理想。原因之一是肿瘤的发生、发展是一个复杂的过程,涉及到多基因的异常以及各种其他因素的作用,单一基因治疗只能作用于肿瘤发生、发展过程中的某一个环节,只有相关的基因

3、共同作用才能更为有效地抑制肿瘤。p53基因是重要的抑癌基因。野生型p53蛋白对细胞周期有重要调控作用,能在DNA受损时促使DNA修复,甚或诱导细胞凋亡。血管内皮生成抑素(angiostatin,AS)对多种肿瘤的生长具有抑制作用,虽然它对肿瘤细胞本身没有直接作用,但可通过抑制或阻断碱性成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)而抑制供应肿瘤组织营养物质的血管内皮细胞的增殖、迁移、并促其凋亡,从而抑制肿瘤组织内新生血管的生成。笔者观察p53、AS共转染对HL60细胞生长的影响,为白血病基因联合治疗提供理论依

4、据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞HL60细胞(福建医科大学药理学研究所提供)生长于内含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,37℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度培养箱中培养。1.1.2基因和试剂携带野生型p53基因、AS基因载体pVITRO2p53Angio(美国Invivogen公司)。筛选抗生素潮霉素(美国Invivogen公司);RNA提取试剂盒Trizol(美国Gibco公司);Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司);质粒抽提试剂盒(QiagenPlasmid

5、Midi,德国Qiagen公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI1640(美国Gibco公司)。RTPCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)逆转录试剂(美国Promega公司);免疫组织化学试剂(武汉博士德生物工程有限公司)。1.2方法1.2.1细胞转染培养大肠杆菌E.coliGT116(质粒载体)扩增质粒,按质粒抽提试剂盒说明书操作;设空载体组、p53组、AS组和p53+AS组,分别取pVITRO2、pVITRO2p53、pVITRO2Angio和pVITRO2p53Angio质

6、粒各2μg,与Lipofectamine20005μL混匀,静置20min,加入HL60培养板进行转染;加入200μg/mL潮霉素筛选,抗性细胞继续培养扩增。1.2.2细胞集落形成实验取对数生长期细胞以每孔1500.5mL1的密度接种于24孔培养板,培养2~3周,肉眼可见集落后加Giemsa应用液200μL染色20min,流水洗去染液,干燥后计算细胞集落数。1.2.3绘制细胞生长曲线取对数生长期的4种细胞按每孔1000的密度接种于96孔板上,分别于接种后24,48,72h，前4h加入5mg/mLMTT溶液20μL,3

7、7℃孵育4h,常温下500r/min离心,用酶标仪测定D(490nm)值,以D(490nm)为纵坐标,以时间为横坐标绘制生长曲线。1.2.4检测细胞周期收集各组细胞(密度为1×106mL-1)送流式细胞仪检测,分析细胞周期。1.2.5RTPCRp53:5’CAGCCAAGTCTGTGACTTGCCGTAC3’CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC94℃3min(94℃30s→56℃30s→72℃30s)×30Ang:5’GAACTACAGAGGGACGATGTCCTC3’CAGAAGATGGTGGAGG

8、TGTTG94℃3min(94℃20s→58℃30s→72℃20s)×35为引物,进行RNA提取和逆转录,行PCR扩增,取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察结果并拍照。1.2.6VEGF、bcl2和bax免疫组织化学检测细胞经PBS冲洗、晾干后,加入DAB显色试剂盒中各1滴,经苏木精对比染色,盐酸返蓝,封固,按