clock基因对雄性小鼠生殖功能影响论文

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1、Clock基因对雄性小鼠生殖功能影响论文何煊成姝婷梁鑫刘延友汪宇辉江舟王正荣【摘要】目的：通过干扰小鼠睾丸精子节律基因Clock的表达，研究Clock对雄性小鼠生殖能力的影响。方法：通过RNAi技术，向小鼠睾丸注射Clock干扰质粒干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达。研究干扰Clock基因后精子数量、精子活力、体外受精率和雌鼠胎仔数变化，以及对精子顶体内透明质酸酶活性、芳香基硫酸酯酶A的含量影响。结果：Clock干扰质粒在体内可影响雄性小鼠的胎仔数，但注射干扰质粒后小鼠精子计数、精子活力及体外授精率无明显变化，精子顶

2、体内透明质酸酶活性和芳香基硫酸酯酶A含量也无明显变化。结论：节律基因Clock与雄性小鼠生殖能力有密切关系。【关键词】Clock基因;RNA干扰;圆形精子;顶体自然界中，近日节律基因广泛存在于生物体内，调控着机体的生命活动。在所有生物体内存在类似的包括Clock、Period等节律基因的转录和转录后调控所形成的分子振荡。其中Clock作为近日节律的核心基因.freelal1形成异二聚体，在近日节律分子振荡中发挥着重要作用。近来研究发现，小鼠生精过程中圆形精子的顶体具有明显的Clock的表达1。而在睾丸中，Clock表达的圆

3、形精子期是小鼠生精周期中顶体发育的关键时期2，利用RNA干扰(RNAi)技术，干扰Clock小鼠睾丸中的表达，发现雄鼠睾丸Clock蛋白的表达明显下调，顶体酶活性明显下降，生殖功能明显下降3，提示节律基因Clock可能与精子的受精能力有关。本文利用RNA干扰(RNAi)技术，干扰Clock在小鼠睾丸中的表达，进一步探讨Clock基因对小鼠生殖功能影响的机制。1材料与方法1.1材料1.1.1动物SPF级ICR小鼠，雄鼠6～8lT6(人脉巴细胞亚群分样)+15mg·ml-1BSA(牛血清白蛋白)培养基的表面皿中，37℃、5%C

4、O2孵箱预平衡过夜。随后将附睾尾剪成四段，在37℃、5%CO2孵箱中孵育30min，让精子充分游出，立即计数精子数量。1.2.1.2精子活力精子从附睾尾释放出来2～4h内，在高倍镜下观察5～10个视野，计数100个精子并进行分级。精子活力分为4级，快速前向运动为+++、慢而呆滞的前向运动为++、非前向运动为+、原地不动为-。1.2.2体外受精(IVF)取20只4～6lT6+20mg·ml-1BSA培养皿内，在解剖镜下用解剖针撕开膨大的壶腹部，将卵丘细胞包围的合子团释放出来。将合子在透明质酸酶溶液中放置到卵丘细胞脱掉为止。用

5、移卵管将合子收集并转移到含新鲜的M2培养液中，洗几次以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞以及杂质。然后将合子转移到微滴培养皿中，用平衡好的培养液洗涤3次后，转入事先在37℃、5%CO2孵箱预平衡过夜T6+20mg·ml-1BSA受精滴中，并准确计数加入到每个受精滴中卵细胞数。把4～10μl孵育过的干扰组和对照组的小鼠精子悬浮液分别加入到含有卵丘卵母细胞复合体的受精滴中，精子浓度为1×106·ml-1左右。将培养皿中加入精、卵细胞的受精滴放回37℃、5%CO2孵箱保持孵育5～6h。用200倍倒置显微镜观察并计数两组20个受精滴中

6、的二细胞数量，即受精卵的数量，评价精子的体外受精率。1.2.3Clock干扰质粒对顶体内的酶的影响1.2.3.1透明质酸酶活性检测4在同时注射干扰质粒和空质粒18d后，分别处死两组小鼠，摘除附睾尾，在PBS中去除附着在附睾上的脂肪，立即放入盛有1mlTYH培养基的表面皿中于37℃、5%CO2孵箱中孵育30min，计数精子数量。300×g离心5min，调整精子浓度达到约108·ml-1。取0.2ml精子悬液，加入1ml0.15mol·L-1的NaCl(1∶5)稀释。取1ml稀释后悬液加入到0.1ml的醋酸盐缓冲液和0.1ml

7、的透明质酸底物的混合物中，37℃恒温孵育24h后，100℃加热5min，进一步冰水浴冷却2-4min。再以500×g离心5min后取上清液，加入60μl的四硼酸钾，100℃水浴5min，冰水浴冷却2-4min。加入2ml的DMAB(二甲胺硼烷)混匀后，37℃水浴中孵育20min。将反应混合物以1500×g离心10min，取上清液。在30min之内测582nm处的吸光度。HAE活性计算方法：一个单位的透明质酸酶的定义是37℃时1h内引起1μmol等量的N-乙酰葡萄糖胺的释放的量。透明质酸酶的活性以x±sd.M.(μmolNA

8、G·h·L-1)表示。1.2.3.2芳香基硫酸酯酶A含量的测定5,6将精子悬浊液350×g离心10min，弃上清液后加入细胞裂解液，调整精子浓度为20×106·ml-1，混匀后4℃孵育5min，4℃、10000×g离心10min，取上清液，按照芳香基硫酸酯酶A(ASA)ELISA检测试剂盒中步骤测定样本