电针体穴治疗对大脑中动脉梗死模型大鼠胆碱乙酰转移酶表达的影响

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1、电针体穴治疗对大脑中动脉梗死模型大鼠胆碱乙酰转移酶表达的影响作者：田明秀陈加俊　怀淑君杨秀峰【摘要】目的观察电针体穴治疗后大脑中动脉梗死模型(MCAO)大鼠胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达变化,为探讨针刺改善学习记忆能力提供理论依据。方法将大鼠随机分为对照组(正常大鼠)、实验组(局灶性脑缺血的大鼠)、治疗组(局灶性脑缺血的大鼠+针刺)，采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术观察各组大鼠ChAT的动态变化。结果治疗组大鼠ChAT活性比实验组有显著提高(P<0.01)，并已接近对照组的正常大鼠。结论M

2、CAO大鼠经针刺治疗后ChAT的阳性表达可能是学习记忆障碍的神经生物学基础之一。【关键词】针刺;大脑中动脉;梗死;胆碱乙酰转移酶;RTPCR中枢胆碱能系统在学习记忆行为中有重要的调节作用。有报道〔1〕学习记忆障碍动物脑中与学习记忆过程相关的神经递质〔如乙酰胆碱(Ach)〕及其酶的含量与代谢存在变化。而胆碱能神经功能紊乱被认为是学习记忆障碍的主要原因，胆碱乙酰转移酶(ChAT)是与学习记忆最相关的神经递质Ach的代谢合成酶，ChAT在记忆相关脑区的含量高低与学习记忆能力成正相关。本实验通过系统观察电针治疗前后大脑中

3、动脉梗死(MCAO)模型大鼠的ChAT表达的改变,探讨学习记忆障碍的神经生物学基础。　　1材料与方法　　1.1模型制备与分组实验用纯系BI产品);TagpluIDNA聚合酶(Sangon产品);DNAMarker、琼脂糖、DEPC、饱和酚等试剂均购自宝生物工程有限公司。ChAT、βactin引物序列。ChAT正义链5′GTCTTGGATGTTGTCATTAATTTC3′;反义链5′TCTCTGGTAAAGCCTGTAGTAAGC3′;扩增片段长度708bp;内参照βactin;正义链5′CTTCTA

4、CAATGAGCTGCGTG3′;反义链5′TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3′;扩增片段长度305bp;以上引物由大连宝生物工程有限公司合成。　　1.4实验方法　　1.4.1提取总RNA采用异硫氰酸胍法提取总RNA。取冰冻组织(0.1～0.2g)剪碎后加入异硫氰酸胍变性液2ml(100mg/ml)，冰上匀浆后，分装，每管各500μl。每管依次加入50μl2mmol/L的乙酸钠;500μl水饱和酚;氯仿/异戊醇(24∶1)100μl，冰浴操作，充分混匀，4℃孵育15min。12000r/min，4℃离

5、心20min，小心移上层水相至另一新的EP管中;加等量的异丙醇，-20℃沉淀1h;4℃，10000r/min离心10min。弃上清，悬RNA于75%乙醇150μl中，振荡，室温孵育10min;4℃，10000r/min离心5min;弃上清，总RNA干燥至透明前。依据总RNA量多少加20～40μl不等的0.1%焦碳酸二已酯(DEPC)溶解RNA。用紫外分光光度仪测总RNA的产量，纯度及浓度(波长260nm/280nm)。　　1.4.2cDNA的合成据总RNA的浓度取适量的总RNA，使逆转录的总RNA量为8μg，先65

6、℃水浴10min，RT反应液中依次加入5×Reactionbuffer4μl;20U/μlRibonucleaseinhibitor1μl;2.5mmol/LdNTPs2μl;100μg/mlOli(dT)181μl;100U/μlAMV2μl;总RNA2～4μl;加0.1%DEPC水至总体积20μl。将上述混合液加入薄壁离心管中，置入PCR仪，反应条件为42℃，60min，后95℃，10min，得到cDNA。　　1.4.3PCR反应PCR反应体系为：D.gCl3μl;2.5mmol/LdNTPs4μl;引物正义链

7、1μl;引物反义链1μl;cDNA10μl;引物浓度为30pmol/μl。①目的基因的扩增：上述反应液先94℃，5min，之后加入TaqplusDNA聚合酶0.5μl/每管，用ChAT的引物进行PCR，循环30个周期。②内标准β肌动蛋白(βactin)的扩增：上述反应液先94℃，5min，之后加入TaqplusDNA聚合酶0.5μl/每管，用βactin的引物进行PCR，循环30个周期。ChAT的PCR反应条件为94℃，30s;60℃，30s;72℃，1min。　　1.4.4PCR产物定量10μlPCR产物经

8、1.2%琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察结果，拍照。通过图像分析将ChAT与βactin灰度比值进行相对定量。　　1.5统计学处理方差齐性检验，两均数比较采用t检验。　　2结果　　造模后大鼠ChAT因缺血荧光定量明显缺失，与正常对照组相比差异有显著性(P<0.01)。治疗组经电针治疗后7dChAT荧光定量接近正常，与实验组相比差异