去甲肾上腺素对thp

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1、去甲肾上腺素对THP作者:陈光军，郭小芳，肖荣，田智【摘要】目的探讨去甲肾上腺素对人THP-1源性巨噬细胞SR-A1表达的影响。方法不同浓度的去甲肾上腺素（10pmol/L～10μmol/L）作用THP-1源性巨噬细胞24h，运用逆转录多聚酶链反应检测其SR-A1mRNA的表达。>P＜0.05）。结论应激状态的去甲肾上腺素能升高THP-1源性巨噬细胞SR-A1基因的表达。【关键词】去甲肾上腺素；THP-1源性巨噬细胞；SR-A1EffectsofnoradrenalineonSR-A1expressioninhumanTHP-1macrophagecells【Abstract】Ob

2、jectiveToinvestigatetheeffectofnoradrenalineontheexpressionofSR-A1inhumanTHP-1macrophagecells.Methods>P＜0.05）.ConclusionStressconcentrationsofnoradrenalincauseSR-A1expressionincreasedinhumanTHP-1macrophagecells.【KeyanTHP-1macrophagecells;SR-A1应激定义为机体在心理、环境或者物理应激原刺激下，激活下丘脑－垂体－肾上腺轴和交感神经系统导致生理的变化

3、或适应［1～5］。反复的或者慢性应激与急性反应物质能共同促进炎症反应，激活巨噬细胞产生自由基，修饰脂质，转变为泡沫细胞和激活凝血途径形成稳定或者不稳定的斑块。因此从细胞水平探究应激性心理社会因素是否参与动脉粥样硬化的过程意义重大。本研究以THP-1巨噬细胞为研究对象，观察去甲肾上腺素对THP-1源性巨噬细胞SR-A1基因表达的影响，以探究应激性心理社会因素在动脉粥样硬化泡沫细胞形成中的作用。1材料与方法1.1仪器和试剂人单核细胞THP-1由中国科学院上海细胞库提供；逆转录多聚酶链反应试剂盒为美国Promega公司产品；Trizol为Invitrogen公司产品；2×TaqPCRMa

4、sterMix为北京天为时代公司产品；鼠抗人SR-A1多克隆抗体及为SantaCruz公司产品；SR-A1和GAPDH引物均由上海生物工程公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯。1.2细胞培养分化与去甲肾上腺素处理人单核细胞系THP-1细胞（购自中国科学院上海细胞库），使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每3天传代1次。于传代后第1天收集细胞，以4×106个接种于25cm2培养瓶，每瓶含8ml培养基，再加入8μl100μmol/L佛波酯（Phorbol12-myristate13-acetate，PMA）使PMA终浓度为100nmol

5、/L，37℃、5%CO2的培养箱中培养3天，显微镜下观察显示此时细胞呈贴壁状态，形状不规则并有伪足伸出，证实THP-1细胞已分化为巨噬细胞，此时更换为含去甲肾上腺素的无血清培养液，各组去甲肾上腺素终浓度为：对照组0，1组10pmol/L，2组100pmol/L，3组1nmol/L，4组10nmol/L，5组100nmol/L，6组1μmol/L，7组10μmol/L，在37℃、5%CO2的培养箱中孵育24h。1.3逆转录聚合酶链反应收集各组THP-1源性巨噬细胞。按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明书提取细胞总RNA。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测RNA的纯

6、度和浓度。取2μg各组细胞总RNA逆转录合成cDNA，再取1μl逆转录产物进行PCR循环。94℃预变性4min，94℃变性1min，退火：GAPDH60℃30s，SR-A159℃1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。循环数：GAPDH28个循环，SR-A134个循环。人GAPDH的引物序列：上游5’-tgtcgctgttgaagtcagag-3’；下游5’-tcaccatcttccaggagcgag-3’。产物长度为696bp。人SR-A1的引物序列：上游5’-ctcctgaagtgggaaacgaag-3’；下游5’-gaggttggcttccatgtctaa-

7、3’。产物长度为183bp。取PCR产物6μl上样于2％琼脂糖凝胶，90V电压，电泳1h后在紫外可见分析装置下拍照。图像采用凝胶成像分析系统获得3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和目的条带的平均灰度值，以目的条带/GAPDH比值变化来衡量各基因表达的相对变化。1.4BST裂解液裂解细胞，于4℃，5000rpm离心10min去除沉淀，BCA法测定蛋白含量，取50μg蛋白加入4×SDS凝胶加样缓冲液中调整蛋白浓度使各组一致，在100℃加热10min使蛋白质变性。配置5％的