柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究

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1、柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究付德才杨世忠宋祥福【摘要】目的探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型αSMA、TGFβ1的影响及其抗纤维化的机制。方法采用40%CCl4皮下注射，制备肝纤维化模型并以柴胡疏肝散干预，测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP)，光镜观察肝组织病理变化，免疫组织化学法检测肝组织αSMA、TGFβ1表达，RTPCR检测TGFβ1mRNA的表达。结果柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善，血清HA及LN显著降低，肝组织HYP含量明显少，肝组织纤维化程度明显改善，肝组织αSMA及TGFβ1表

2、达减少。结论柴胡疏肝散对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。【关键词】柴胡疏肝散；肝纤维化；αSMA；TGFβ1　　近年来柴胡疏肝散抗肝纤维化的临床研究取得了较好的临床效果〔1〕，但目前国内外尚无柴胡疏肝散抗肝纤维化的基础研究。本实验采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型,观察柴胡疏肝散的抗肝纤维化作用,并探讨其对α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、转化生长因子(TGFβ1)影响及柴胡疏肝散抗肝纤维化的理论机制。　　1材料与方法　　11材料　　111动物及药物雄性22月龄A试剂盒购自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体购自武

3、汉博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB购自北京中山生物公司，RTPCR两步法试剂盒购自TAKARA公司，Trizol购自Sangon公司。　　12方法　　121模型制作参照文献〔2〕方法：实验第1天除正常空白对照组(对照组)外,其余动物皮下注射CCl4分析纯05ml/100g(体重),以后每隔3d注射40%CCl4橄榄油剂03ml/100g(体重),连续8g/(kg·d)-1，共8l，制备成100g/L肝组织匀浆，4000r/min4℃离心，取上清液保存于-20℃。肝右叶置于40g/L中性甲醛液中常规固

4、定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。　　13检测指标　　131血清及组织纤维化指标检测测定血清肝功能包括总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，检测透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，N型胶原()，层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测羟脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，均按试剂盒说明书操作。　　132病理检测组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)

5、〔3〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。　　133免疫组织化学检查αSMA、TGFβ1采用石蜡包埋常规切片,SP法,兔抗鼠TGFβ1,多克隆抗体及鼠抗鼠αSMA单克隆抗体均以1∶100稀释,DAB显色,苏木素复染。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色在全自动图像分析系统上，采用HPIAS2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取其乘积平均值为该组织切片所得值，两项乘积越大表明组织中该抗原含量越高。　　134RTPCR检测大鼠GAPDH上游引物

6、:5＇CATGACCACAGTCCATGCCATC3＇,下游引物：5＇CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC3＇全长450bp；TGFβ1上游引物：5＇TGAGTGGCTGTCTTTTGACG3＇，下游引物：5＇ACTTCCAACCCAGGTCCTTC3＇全长350bp。αSMA上游引物：5＇AAGAGGAAGACAGCACAGCTC3＇,下游引物：5＇GATGGATGGGAAAACAGCC3＇称取50～100mg肝组织用Trizol提取总RNA，采用分光光度法测定其含量及纯度，测定A260/A280值。取2μg总RN

7、A，42℃逆转录90min。参数设置94℃变性,3min×1循环。94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环。最后72℃彻底延伸7min×1循环。同法扩增GAPDH作为内参照。取5μlPCR产物15%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测灰度,TGFβ1/GAPDH比值表示TGFβ1mRNA相对水平。αSMA/GAPDH比值表示αSMAmR2NA相对水平。　　14统计学分析实验结果计量数据以x±s表示，经SPSS1110软件包进行方差分析，组间比较采用t检验。　　2结果　　21各组大鼠肝功能改变模型组ALT、AST显

8、著升高,ALB显著降低；干预组ALT、AST较模型组明显降低,ALB则显著升高。