资源描述：
《耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的比较论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的比较论文李蓓，刘晶靖，孙竞，范金明，朱怡，熊琛关键词金黄色葡萄球菌;甲氧西林;乳胶凝集试验耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是临床院感的常见致病菌，目前用于检测的的纸片法虽然简便，但其敏感性和准确率都不太理想。而PCR扩增mecA基因对试验条件的要求又比较高。检测mecA基因编码产物PBP2a的表达将是判断金黄色葡萄球菌对甲氧西林是否耐药的最直接证据1。基于此基础上的快速乳胶凝集检测试剂盒在美国已经获得FDA认证.freelecA基因的全序列，通过Arraydesign
2、er软件设计相应的引物，MecA-F,5'-CAAGATATGAAGTGGTAAATGGT-3'MecA-R,5'-ACTGCCTAATTCGAGTGCTAC-3'送上海生物工程公司合成。DNA标准分子量标准购自北京天为时代公司。1.2方法1.2.1实验菌株的确定：所有菌株均以常规方法培养分离，革兰氏染色、血浆凝固酶试验和生化试验进行鉴定，确定为金黄色葡萄球菌。1.2.2纸片扩散法检测:此方法为临床检验科常用方法。苯唑西林含量为1g/片,平皿中M-H琼脂厚度为4mm,菌液调至0.5麦氏浊度涂布于含20g/
3、LNaCl的M-H平板上。在35℃环境下孵育24h。抑菌直径≤10mm即判断为耐甲氧西林菌株2。1.2.3PCR法检测：取分离、鉴定为金黄色葡萄球菌的单个菌落，用无菌生理盐水配成1个麦氏浓度，取菌悬液10μl100℃水浴10min，15000rpm离心5min后取上清5μl作为mecA基因扩增的模板。扩增程序：94℃7min,94℃30s、55℃30s、72℃50s经30个循环后，72℃7min；扩增产物的检测：取扩增产物10μl于1.0%琼脂糖（内含0.5g/L溴乙啶）TBE缓冲系统进行电泳，在紫外光下
4、检测，在533bp出现条带样本而阴性对照无则被认为阳性。1.2.4快速乳胶凝集检测试剂盒检测：将大约3～5μl（约10～20个菌落）金黄色葡萄球菌悬浮于200μl试剂盒所带的提取液Ⅰ中，100℃加热3min，室温下自然冷却加入25μl提取液Ⅱ，混匀后3000rpm室温离心5min，取50μl上清液于对照圈，加入PBP2a无特异性单克隆抗体致敏的乳胶颗粒溶液25μl，作为阴性对照；再取50μl上清液于试验圈中，加入25μl的PBP2a特异性单克隆抗体致敏的乳胶颗粒溶液；摇动3min，于自然光下观察有无凝集颗
5、粒出现。试验圈有凝集颗粒出现的菌株为阳性。2结果结果见表1，在52株临床分离出的金黄色葡萄球菌中，药物纸片法与快速乳胶凝集试验均检测出26株甲氧西林耐药的菌株，而PCR基因扩增的方法检测出28株对甲氧西林耐药的菌株，其中的26株菌三种检测方法均证明为耐甲氧西林菌株。经过χ2检验表示3种检测方法间的差异无明显意义。表1三种方法检测MRSA的敏感性及特异性比较（略）3讨论本研究采用的乳胶结合试验,是近2～3年国外学者推出的检测MRSA的新方法。其基本原理是检测细菌是否合成PBP2a而判断细菌是否为MRSA。此
6、方法简便、快速、准确,检测1份标本全部用时只需15min。对mecA基因扩增阳性而PBP2a检测阴性的2株菌再次利用乳胶试剂盒进行检测,结果仍为阴性,可能与PBP2a在这些菌株中的表达量低有关，提高待测细菌的量(挑取50个菌落)以及延长凝集反应时间(10min)可提高阳性率,且不会因此而降低敏感性3。此试验虽然表明3种检测方法结果无明显差异，但这可能是由于检测的样本数量有限所造成的。PCR法被认为是耐甲氧西林金葡菌检测的"金标准"，但由于其对试验条件要求比较高而且可能出现假阳性结果而不能在一些基层医院开展
7、。在实际工作中，纸片法操作比较简单，设备简单，价格便宜但可能会造成漏诊，对纸片法检测阴性的菌株再进行乳胶结合试验将是指导临床更好的选择用药、有效进行治疗的手段。参考文献1HiramatsuK,CuiL,KurodaM.Theemergenceandevolutionofmethicillin-resistantStaphylococcusaureusJ.TrendsMicrobiol,.freelunityandhospitalisolatesofStaphylococcusaureusJ.Patholo
8、gy,2001,33(4):493-495.3NationalmitteeforClinicalLaboratoryStandards.Perform～ancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytestingS.Approvedstandard-seventheditionM100-S10(M7).Pennsylvania:NCCLS,2000.
