恶性骨肿瘤来源成纤维母细胞促进溶骨作用

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1、恶性骨肿瘤来源成纤维母细胞促进溶骨作用作者：孙嗣国，马保安，周勇，张明华，范清宇【关键词】破骨细胞摘要：［目的］检验恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞是否能够支持破骨细胞分化及其溶骨作用。［方法］酶消化法从肿瘤组织中分离成纤维母细胞并作体外培养。细胞传代后，一部分成纤维母细胞与外周血单核细胞共培养，分别加入MCSF、骨保护素（OPG）及抗TNFα中和抗体。同时，作者还应用了TransRNA的表达。［结果］在MCSP存在的条件下，2种细胞共培养组分别于14、21d观察到TRAP阳性的多核细胞和骨吸收陷窝形成；大剂量OPG彻底阻断TRAP阳性多核细胞及骨吸收陷窝的形

2、成，而大剂量抗TNFα中和抗体对成纤维母细胞支持的破骨细胞形成未显示抑制作用。RTPCR结果显示恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞能够表达RANKL和TNFαmRNA。［结论］在MCSF存在的条件下，恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞通过表达RANKL支持破骨细胞分化及其溶骨作用。关键词：破骨细胞；溶骨作用；细胞核因子кB受体活化因子配体；成纤维母细胞Abstract：［Objective］Toinvestigatemalignantbonetumorcouldsupportosteoclastdifferentiationandboneresorption［Meth

3、od］Fibroblastsisolatedfrom8freshtumorsamplesonocytesMCSF,OPGandneutralizingantiTNFαantibodyinedfortheformationoftartrateresistantacidphosphatase（TRAP）positivemultmucleatedcells（MNCs）andlacunaresorptionpitsrespectivelyThenumberoflacunaresorptionpitsonboneslices,arkerofOCactivity,ed

4、toinvestigatetheexpressionofRANKLandTNFαmRNAinthefibroblasts［Result］TRAPpositiveMNCsandlacunapitsberoflacunapitsationofTRAPpositiveMNCsandlacunapits,RNAmalignantbonetumorarecapableofsupportingosteoclastformationandactivitythroughexpressionofRANKLKeyl青霉素，10μg／ml链霉素和10mmolL谷氨酸（Invit

5、rogen,UK）及10％胎牛血清（MEM／FBS）（GibcoLaboratories，UK）。乙二胺四乙酸钠、重组MCSF和抗TNFα中和抗体购于RDsystems，Inc（UK）。Ⅰ型胶原酶及RANKL拮抗剂RANK：Fc购自SigmaAldrichChemicals（UK）。RANKL和OPG由AfsieSabokbar博士（NuffieldOrthopaedicCentre，UniversityofOxford,UK）惠赠。所有的细胞培养均在37℃、5%CO2条件下进行。抗酒石酸磷酸酶（TRAP）染色试剂盒购于SigmaAldrichChemic

6、als（UK）。RNeasyMinikitRNA提取试剂盒购于Qiagen（UK）。cDNA合成试剂盒购于GibcoLaboratories（UK）。PCR引物由RDsystems，Inc（UK）合成。12成纤维母细胞的分离和培养新鲜肿瘤组织标本取自8名在Nuffield骨科中心行手术治疗的骨肿瘤患者（6名男子和2名女子；年龄14~45岁），其诊断均经术后病理检查证实（软骨肉瘤3例；骨肉瘤5例，其中1例同时患有畸形性骨炎）。将标本切成1mm×1mm×1mm的组织块，加入适量Ⅰ型胶原酶在37℃条件下在摇床上消化45min，加入等体积乙二胺四乙酸钠在相同条件下

7、消化35min;滤网去除残留组织块，收集滤液300g离心10min；MEM／FBS重悬细胞并将细胞悬液加入35ml培养瓶，孵育2h后更换培养液，以后每周更换培养液2次；待细胞长满后按1∶5传代。待细胞覆盖培养瓶90％时收集细胞，一部分与PBMCs共培养，另一部分用于提取RNA。13外周血单核细胞（PBMCs）的分离新鲜全血由8名健康成年男子〔（30±6）岁〕提供。将外周血按1∶2稀释于MEM后缓慢加到Histopaque（SigmaChemicals，UK）上层，离心（693g）30min。吸取处于界面层的细胞，重悬于MEM并离心（600g）10min，重

8、复2次，然后重悬于MEM／FCS。体积分数为005（5％）的醋酸溶