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1、HPLC法测定蛤蚧中胆甾醇含量论文.freelm×150mm,5μm)；流动相：甲醇；检测波长208nm；柱温40℃；流速为1.0mL/min。结果胆甾醇质量在0.885～14.000μg范围与峰面积值的线性关系良好(r＝0.9995),平均回收率99.65%,RSD＝3.45%(n＝6)。结论本方法简便可行、快速准确,可用于蛤蚧中胆甾醇的含量测定。【关键词】蛤蚧；胆甾醇；高效液相色谱法；含量测定Keyination蛤蚧系名贵中药,具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精之功效,多用于治疗肺虚气喘、咳血、阳痿遗精等。现代药理研究表明,蛤蚧的脂溶性提取物有抗炎和性激素样作用。胆甾醇是
2、脂溶性提取物中的主要成分之一,因此,从蛤蚧中分离出胆甾醇并对其进行定量测定具有重要意义。胆甾醇的测定方法主要有吸光光度法、气相色谱法与高效液相色谱法。吸光光度法成本低,操作简单,但只能测定总甾体的含量,.freela公司(C8667)。甲醇为色谱纯(Fisher公司)；石油醚、无水乙醇、正己烷、氢氧化钾均为分析纯(北京化工厂)。2方法与结果2.1色谱条件对胆甾醇标准溶液在200～400nm波长处进行扫描,在208nm处有最大吸收。色谱柱：HypersilODS2柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相：甲醇；检测波长208nm；柱温40℃；流速：1.0mL/min。2.
3、2对照品溶液的制备精密称取胆甾醇对照品9.39mg,置于10mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,即得0.939mg/mL的对照品溶液。2.3供试品溶液的制备取蛤蚧粗粉约0.5g,精密称定,置索氏提取器中,以30mL石油醚(30～60℃)回流提取5h,回收石油醚并将浸膏挥至无醚味,精密称定浸膏0.0291g,加入4mL0.5mol/L氢氧化钾的乙醇溶液混匀,置80℃水浴中皂化20min,皂化过程中每5min涡旋30s,以保证脂肪完全皂化,皂化液冰水中冷却,向其中加入0.8mL蒸馏水混匀,再加入4mL正己烷,离心2min(500r/min),取上层有机相,用N2吹干,残渣
4、用甲醇0.5mL涡旋溶解,0.45μm有机膜过滤,收集滤液作为供试品溶液。2.4系统适应性考察分别吸取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各15μL,按照“2.1”项下色谱条件进样测定,色谱图见图1。样品中胆甾醇得到较好分离,其色谱峰的保留时间和标准品一致。2.5线性关系的考察精密吸取胆甾醇对照品溶液50、100、200、400、800、1600μL,用甲醇稀释成0.029、0.059、0.117、0.235、0.470、0.939mg/mL标准溶液,按上述色谱条件进行测定,每次进样15μL,同一浓度重复进样3次,测得峰面积。以峰面积为纵坐标、胆甾醇浓度为横坐标绘制标准曲线,通
5、过回归计算,得到回归方程：Y＝2×10－7X－0.0217,r＝0.9995,线性范围0.435～14.085μg。2.6精密度试验取标准品溶液,浓度分别为0.029、0.235、0.939mg/mL,各进样15μL,每种溶液在同一天测定6次,并连续测定3d,计算低、中、高3种浓度标准品溶液的日内RSD分别为3.89%、4.11%、4.04%,日间RSD分别为3.59%、4.21%、4.15%。2.7稳定性试验取同一份供试品溶液,分别于2、4、6、8、10、12h进样分析,记录胆甾醇峰面积,结果RSD＝3.65%,表明样品溶液在12h内性质稳定。2.8重复性试验取同一批蛤蚧
6、药粉共6份,每份0.5g,精密称量,按照“2.3”项下方法制备供试品溶液,进样测定胆甾醇峰面积,结果RSD＝2.75%,表明该条件重复性好。2.9回收率试验精密称取已知含量的蛤蚧药粉(070708)6份,分别精密加入一定量的胆甾醇对照品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,测定胆甾醇的含量,计算回收率,结果见表1。表1回收率测定结果(略)2.10样品测定取蛤蚧药粉5批,按“2.3”项下供试品溶液制备方法,按上述色谱条件进行含量测定,用外标法计算。5批样品的胆甾醇含量见表2。表2样品中胆甾醇含量测定结果（略）3讨论蛤蚧样品采用石油醚作提取溶剂,索氏提取器回流提取,并用紫外扫描
7、的方法监测提取终点,大约5h时提取液在紫外208nm处无吸收,因此,确立样品回流提取时间为5h,试验表明,该法提取完全,回收率好。在对蛤蚧脂溶性提取物进行皂化时借鉴了微型皂化方法4,分别考察了2、3、4、5mL的0.5mol/L氢氧化钾的乙醇皂化效果,确定4mL为皂化最佳剂量。文献报道中有用电化学检测器5、蒸发光散射检测器6的高效液相色谱法测定胆甾醇含量。本试验采用紫外检测器的高效液相色谱法,选用HypersilODS2色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),以甲醇作流动相就可以达到良好的分离效果,而且峰形对称,
