野生型klf6对前列腺癌lncap细胞的作用论文

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1、野生型KLF6对前列腺癌LNCaP细胞的作用论文孙明黄健林天歆庞健廖勇彬胡明陈学中【摘要】目的：探讨野生型抑癌基因KLF6对前列腺癌LNCaP细胞的生长增殖、细胞周期和侵袭转移能力的影响及其可能的作用机制.方法：利用RTPCR法克隆目的基因KLF6，并将含KLF6的pEGFPC1质粒转染入LNCaP细胞.分为转染组和对照组分别进行MTT法观察LNCaP细胞的生长抑制率,流式细胞仪观察细胞周期比例变化和凋亡率,细胞爬片划痕法观察LNCaP细胞的侵袭转移能力变化.结果：转染了野生型抑癌基因KLF6的前列腺癌LNCaP细胞生长抑制率为(31.9

2、±4.7)%，对照组为0%,差异有统计学意义（P0.01），细胞周期比例表现为G2/M期减少，G0/G1期比例增加为(75.0±8.8)%，对照组为(55.9±7.1)%,差异有统计学意义（P0.05），细胞凋亡峰为(29.3±3.7)%，对照组为(8.6±0.9)%,差异有统计学意义（P0.01）；每毫米划痕区内迁移入的细胞数为102.8±15.4.freeligrationofprostatecancercelllineLNCaPbytransgenicmethod.METHODS:TTeterforapoptosisandcycleph

3、ase,.freelentforcellinvasioncapabilityethodfor48h.RESULTS:Aftermigratedcellpopulation/mm2,(102.8±15.4)vs（192.7±25.2）,P0.05］.,increasedratioofG0/G1fromcontrolgroup(55.9±7.1)%totransfectiongroup(75.0±8.8)%(P0.05).CONCLUSION:I1640培养液（Gibco公司）中，添加100IU/mL青霉素及100mg/L链霉素.37℃,50m

4、g/LCO2的条件下常规培养.1.2.3噻唑蓝（MTT）法观察细胞生长抑制率将5×106/L的前列腺癌LNCaP细胞和转染KLF6后的LNCaP细胞接种于96孔板，每孔200μL，贴壁生长48h后，弃上清后，每孔加入200μL新配制的5g/L的MTT,37℃继续孵育4h，弃上清加入150μL的二甲基亚砜（DMSO），混匀后于DG3022型酶标仪，在490nm波长测定吸光度（A）.细胞生长抑制率=（1-实验孔测定值/对照孔测定值）×100%.重复实验3次,结果取平均值.1.2.4流式细胞仪分析LNCaP细胞和转染后的KLF6LNCaP细胞，消

5、化分离为1×106/mL的单细胞悬液，离心后用0.1mol/L的PBS液洗涤3次，700mL/L乙醇固定30min,10g/L的TritonX10010mL处理10min,10g/L的RNase1mL处理10min,2.5g/L的碘化丙锭染色30min,采用美国Coulter公司EliteESP型流式细胞仪分析.重复实验3次,结果取平均值.1.2.5细胞迁移实验取处于对数生长期的转染前后的LNCaP细胞，制成单细胞悬液，按2×104个细胞/孔将细胞加入24孔细胞培养板，50ml/LCO2条件下37℃孵育4～6h，在约60%～80%融合的单层

6、细胞表面划出一约2mm无细胞的细痕.用PBS漂洗3次以去除划下的细胞.加入新鲜无血清培养液继续培养24h后，显微镜下计数迁移到单位长度划痕区的细胞数.每组做3复孔平行样.统计学处理：所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS12.0统计软件进行处理，采用t检验，其中P0.05代表差异有统计学意义.2结果2.1PCR反应及质粒构建样本经过RTPCR反应，显示电泳在约852bp位置出现条带，为KLF6的cDNA.KLF6pEGFPC1质粒载体构建完成后，酶切鉴定并测序，结果与已知序列一致.2.2KLF6阳性克隆细胞的筛选荧光显微镜

7、检查可见成功转染了pEGFPC1表达绿色荧光蛋白的阳性表达细胞，并采用G418筛选获得足够数量阳性克隆的含KLF6基因的LNCaP细胞，以KLF6基因引物进行RTPCR扩增出KLF6的cDNA证明转染成功.2.3KLF6的表达对LNCaP细胞生长的抑制作用MTT法观察及细胞生长曲线显示，转染KLF6基因后的LNCaP细胞生长增殖受到明显的抑制，生长抑制率为(31.9±4.7)%,对照组为0%(P0.01）.2.4细胞周期及DNA含量的变化流式细胞仪定量检测表明，转染野生型KLF6后的LNCaP细胞生长24h时即有微弱的凋亡峰出现,48h后

8、出现较为明显的凋亡峰［Ap峰=(29.3±3.7)%］,与对照组(8.6±0.9)%比较差异有统计学意义（P0.01）.转染野生型KLF6后48h,G0/G1期细胞