白藜芦醇体外及小鼠体内抗白血病作用机制

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1、白藜芦醇体外及小鼠体内抗白血病作用机制【摘要】　　目的：探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）体内外抗白血病作用的分子机制。　　方法：采用HuT78、Jurkat和L12103种白血病细胞株，不同浓度Res作用不同时间后，应用甲基噻唑基四唑（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白印迹法检测Bcl2和Bax蛋白表达，免疫沉淀法检测信号转导子和转录激活子（signaltransducersandactivatorsoftranscription，STAT）3及其磷酸化活性（phosphoTyr705ST

2、AT3,pSTAT3）。BALB/c小鼠随机分为模型组和12.5、25、50mg/(kg·d)Res组，皮下注射L1210细胞建立白血病模型。逆转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RTPCR）检测各组白血病小鼠外周血T淋巴细胞白细胞介素6（interleukin6,IL6）基因表达，流式细胞仪检测IL6蛋白分泌，免疫组织化学法和蛋白印迹法检测肝脏活性pSTAT3蛋白表达。　　结果：Res能抑制白血病细胞HuT78、Jurkat、L1210的生长增殖，诱导细胞凋亡，同时明显下调Bcl2/Bax比值、降低

3、活性pSTAT3的蛋白表达；Res还能够剂量依赖地下调白血病小鼠外周血T淋巴细胞IL6mRNA表达及其胞内分泌，同时降低小鼠肝组织中活性pSTAT3蛋白表达水平。　　结论：Res体内外均具有明显的抗白血病效应，其作用机制可能与其对IL6及pSTAT3的影响有关。【关键词】白藜芦醇;细胞凋亡;白血病;白细胞介素6;STAT3转录因子;信号转导接头蛋白类;小鼠;体外研究　　Methods:Threekindsofleukemiacelllines,HuT78,JurkatandL1210cells,ent,methylthiazolyltetrazolium(MTT)colorim

4、etryetry;SO）成1g/L，滤过除菌，－20℃贮存。用时以RPMI1640细胞培养基稀释至所需浓度，使DMSO终浓度不高于0.1%，此时对细胞生长活性无影响。台盼蓝染色法活细胞计数≥95%，调整细胞浓度为5000个/ml，以6.25、12.5、25、50、100和200μmol/LRes分别培养HuT78、Jurkat和L1210细胞12、24和48h。加入5mg/ml甲基噻唑基四唑（methylthiazolyltetrazolium，MTT），终浓度0.2mg/ml，再培养4h，弃上清，加入DMSO溶解沉淀，570nm处测定吸光度（absorbance,A）值，计数细胞生长抑

5、制率及半数抑制浓度（inhibitingconcentration50%,IC50）。　　1.3AnnexinV法检测细胞凋亡调细胞终浓度为1×105个/ml，用100μmol/LRes培养HuT78、Jurkat和L1210细胞12、24和48h，空白对照组加等体积RPMI1640培养基。FITC标记的AnnexinV和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色后，通过流式细胞仪(FACScan型，美国BD公司)定量检测各组细胞凋亡情况。　　1.4蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl2、Bax的相对表达以IC50Res培养各组白血病细胞24h，蛋白印迹法分析Res对凋亡相关

6、蛋白Bcl2和Bax的影响。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis,SDSPAGE），半干法转膜1.5h，加入相应一抗（1︰200稀释）及辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）标记的二抗（1︰5000稀释），增强化学发光（enhancedchemiluminescence,ECL）法检测，最后进行图片扫描和分析，采用QuantityOne软件进行数据处理，以βactin蛋白为内参照进行半定量分析。　　1.5免疫沉淀法检测活性pSTAT3蛋白表达0.5%血

7、清饥饿12h，以25、50和100μmol/LRes培养HuT78、Jurkat和L1210细胞24h，并设空白对照组。提取细胞蛋白，以充分重悬的蛋白G琼脂糖（proteinGagarose）进行沉淀，BCA法测定蛋白浓度，分别取各组细胞50μg总蛋白进行SDSPAGE电泳，pSTAT3稀释倍数为1︰1000，以非磷酸化抗体作内标参考。　　1.6动物给药及模型建立参见　　2.6Res下调白血病小鼠活性pSTAT3