i型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制vsmc增殖及内膜增生论文

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1、I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生论文.freelolL-1）导入血管周围，术后不同时间观察增生内膜相对厚度.结果ODN于培养后12h进入细胞内，并逐渐增加;15μmolL-1ETA-ODN对VSMC增殖具有抑制作用，24h后即有显著作用;ETA-ODN对ETA表达亦有明显的抑制作用，表现为CPM于24h逐渐减少;ETA-ODN导入后，血管增生内膜相对厚度减少.结论ETA-ODN以浓度和时间依赖方式抑制ETA蛋白表达以及VSMC的增殖;反义寡核苷酸是通过反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用.Antisenseendothe

2、lin┐1receptoroligonucleotidein┐hibitvascularsmoothmusclecellproliferationandintimalhyperplasiaAbstract:AIMToevaluatetheinhibitiveeffectofantisenseendothelin-1receptoroligonucleotide（ODN）onVSMCgroalhyperplasia.METHODS①Cellcul-ture.ThemediumofrabbitaortaentarytoETAcDNAentedandmembr

3、anouspermeabilitytested.③MTTmethodmuno-histochemistryineproteinexpressionofthereceptor，andtodiscussrolesoftheODN.⑤ODNdis-solvedin200mLL-1F-127gelsolutionatconcentrationof3.0μmolL-1althicknessandluminalnarroolL-1suppressedVSMCproliferation，enasthatCPMprogressivelydecreasedin24h.④I

4、ntimalthicknessandlu-minalnarroeandconcentrationdependentmanner.ETAplaysanimportantroleinmediatingculturedVSMCproliferationcourse.ETA-ODNexertsinhibitoryfunctionthroughantisensemechanism.0引言血管移植或动脉腔内成形术后血管内膜均不同程度地发生增生，严重的可致血管狭窄或再狭窄.内膜增生的细胞学基础是血管中膜平滑肌细胞（SMC）向内膜迁移并增殖，因此若能控制血管SMC（VS

5、MC）增殖即可实现抑制内膜增生.既往人们用化学药物，如阿斯匹林、潘生汀、肝素和类皮质激素等试图抑制血管内膜增生［1］，但效果均不理想.近年来的研究证明I型内皮素（ET-1）在诱导血管收缩和VSMC增殖方面起重要作用，在动脉粥样硬化的VSMC中，Ⅰ型内皮素受体（ETA）mRNA表达显著增多［2］，而且ET-1可增加VSMC内3H-TdR结合率［3］，增强PDGF诱导的DNA合成［4］.现已明确，ET在血管内膜增生中发挥着重要的促分裂效应.作为基因治疗的一方面，反义技术已逐渐成为血管领域的重要的治疗方法［5］.针对ET-1及其受体ETA在血管SMC增殖和内膜

6、增生中的重要作用，我们合成了含18bp的ETA反义寡聚核苷酸（ODN），并经硫代膦酸修饰，在离体SMC培养和动物在体模型基础上探讨ODNS对VSMC上ETA蛋白表达、SMC增殖和内膜增生的影响，为防治血管内膜增生和血管狭窄提供实验依据.1材料和方法1.1细胞培养无菌取家兔主动脉段，去内外膜置100mLL-1NBSDMEM培养液中，剪碎，吸去DMEM，加1.25gL-1胰蛋白酶震荡消化45min，低速离心（1000rmin-1），弃组织块，收集上清液加培养液移至培养瓶（75mL），置37℃，50mLL-1CO2孵箱.取用第4～6代细胞，多余细胞分装冻存备用

7、.1.2SMC鉴定将SMC按每孔1×104个细胞转种于置有无菌载玻片的6孔板内，37℃，50mLL-1CO2孵箱内培养，细胞贴壁生长至一定密度时取出载玻片，免疫组化（ABC）染色后观察.1.3反义核苷酸的设计合成根据已克隆的大鼠ETA核酸序列［6］，经中科院上海生化所Genebank检索后，分别筛选并设计特异性高的含18bp的反义片段，DNA合成仪合成30A的寡核苷酸.同法合成相应的正义片段.另外合成标有地高辛的反义ETA10A，以验证反义核酸的膜穿透性.5'端碱基硫代磷酸化修饰以增加寡核苷酸在血清中的稳定性.1.4ODN的膜透性检测将地高辛修饰标记的E

8、TAODN（10μmol）与SMC共培养，爬片生长，孵箱培养4，12，24和48