i型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制vsmc增殖及内膜增生

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1、I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生作者：钱济先，张柏根，李桂云，张岚，邓廉夫，朱雅萍【关键词】内皮素　　关键词:内皮素;反义寡核苷酸;血管平滑肌细胞　　摘要:目的观察Ⅰ型内皮素受体（ETA）反义寡核苷酸（ODN）对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和内膜增生的抑制作用.方法①细胞培养:取家兔主动脉中膜消化后培养传代，经抗α-actin鉴定后使用第4～6代传代细胞;②人工合成ODN:经Genbank检索筛选，合成含18bpETA-ODN片段，再对5'端硫代修饰以增加稳定性，同时行地高辛标记以检测反义片段

2、的细胞膜穿透性;③MTT分光光度法检测ETA-ODN对VSMC增殖的抑制作用;④运用放射受体结合分析法（125I-ET-1）了解ODN对ETA蛋白表达的抑制作用，以探讨其反义作用;⑤兔颈动脉空气干燥模型在体研究ODN对血管内膜增生的抑制作用:应用F-127凝胶载体携带ETA-ODN（3.0μmolL-1）导入血管周围，术后不同时间观察增生内膜相对厚度.结果ODN于培养后12h进入细胞内，并逐渐增加;15μmolL-1ETA-ODN对VSMC增殖具有抑制作用，24h后即有显著作用;ETA-ODN对ETA表达亦有明显的抑

3、制作用，表现为CPM于24h逐渐减少;ETA-ODN导入后，血管增生内膜相对厚度减少.结论ETA-ODN以浓度和时间依赖方式抑制ETA蛋白表达以及VSMC的增殖;反义寡核苷酸是通过反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用.　　Antisenseendothelin┐1receptoroligonucleotidein┐hibitvascularsmoothmusclecellproliferationandintimalhyperplasia　　Abstract:AIMToevaluatetheinhibit

4、iveeffectofantisenseendothelin-1receptoroligonucleotide（ODN）onVSMCgroalhyperplasia.METHODS①Cellcul-ture.ThemediumofrabbitaortaentarytoETAcDNAentedandmembranouspermeabilitytested.③MTTmethodmuno-histochemistryineprotEInexpressionofthereceptor，andtodiscussrolesoft

5、heODN.⑤ODNdis-solvedin200mLL-1F-127gelsolutionatconcentrationof3.0μmolL-1althicknessandluminalnarroolL-1suppressedVSMCproliferation，enasthatCPMprogressivelydecreasedin24h.④Intimalthicknessandlu-minalnarroeandconcentrationdependentmanner.ETAplaysanimportantrolei

6、nmediatingculturedVSMCproliferationcourse.ETA-ODNexertsinhibitoryfunctionthroughantisensemechanism.　　0引言　　血管移植或动脉腔内成形术后血管内膜均不同程度地发生增生，严重的可致血管狭窄或再狭窄.内膜增生的细胞学基础是血管中膜平滑肌细胞（SMC）向内膜迁移并增殖，因此若能控制血管SMC（VSMC）增殖即可实现抑制内膜增生.既往人们用化学药物，如阿斯匹林、潘生汀、肝素和类皮质激素等试图抑制血管内膜增生［1］，但效果均不理

7、想.近年来的研究证明I型内皮素（ET-1）在诱导血管收缩和VSMC增殖方面起重要作用，在动脉粥样硬化的VSMC中，Ⅰ型内皮素受体（ETA）mRNA表达显著增多［2］，而且ET-1可增加VSMC内3H-TdR结合率［3］，增强PDGF诱导的DNA合成［4］.现已明确，ET在血管内膜增生中发挥着重要的促分裂效应.作为基因治疗的一方面，反义技术已逐渐成为血管领域的重要的治疗方法［5］.针对ET-1及其受体ETA在血管SMC增殖和内膜增生中的重要作用，我们合成了含18bp的ETA反义寡聚核苷酸（ODN），并经硫代膦酸修饰，在

8、离体SMC培养和动物在体模型基础上探讨ODNS对VSMC上ETA蛋白表达、SMC增殖和内膜增生的影响，为防治血管内膜增生和血管狭窄提供实验依据.　　1材料和方法　　1.1细胞培养　　无菌取家兔主动脉段，去内外膜置100mLL-1NBSDMEM培养液中，剪碎，吸去DMEM，加1.25gL-1胰蛋白酶震荡消化45min，低速离心（1000rmin-