参芪注射液对h22荷瘤小鼠抑瘤作用的细胞免疫机制

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　　参芪注射液对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的细胞免疫机制梅龙，董晓慧，段刚，苟伟【摘要】目的研究参芪注射液的体内抑瘤效应与荷瘤机体细胞免疫功能的关系,探讨其抑瘤作用的细胞免疫学机制。方法建立小鼠H22肝癌实体瘤模型，分别给予高、中、低剂量参芪注射液，测定各组小鼠肿瘤生长抑制率(IR)和腹腔巨噬细胞的吞噬指数；采用MTT法测定各组小鼠脾淋巴细胞增殖指数；ELISA法检测各组小鼠血清中白细胞介素2(IL2)和γ干扰素(IFNγ)水平。结果高、中剂量参芪注射液实验组小鼠H22实体瘤IR分别为60.72%和48.65%，与模型组比较有显著性差异(P0.05)；参芪注射液实验组小鼠脾脏淋巴细胞增值指数、腹腔巨嗜细胞吞噬指数、血清IL2和IFNγ的含量都显著高于模型组小鼠(P0.05)。结论参芪注射液通过提高荷瘤小鼠的细胞免疫功能，改善荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫状态，协同对肿瘤细胞的直接杀伤作用，在荷瘤小鼠体内发挥其抑瘤抗瘤作用。【关键词】荷瘤小鼠；参芪注射液；抑瘤率；白细胞介素2；γ干扰素；细胞免疫功能　　Cellularimmunemechanismofantitumorefficacyof　ShenqiinjectioninH22tumorbearing mice　　ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetherelationshipbetorefficacyofShenqiinjectionanditseffectonimmunologicfunctioninH22tumorbearingmodelmice,andexplorethecellularimmunologicmechanismofShenqiinjectionininhibitingtumorgroorbearingmodelmiceintreatmentgroups.ThetumorgroacrophagephocytesstimulatedbyConAinvitroseparatedfromH22tumorbearingmice.MurineserumIL2andIFNγeansofELISAassay.ResultsIRentgroupsparedodelmice(60.72%,48.65%,P0.05).Thespleenlymphocytestimulationindex,theindexofphagocytosis,andthelevelofserumIL2andIFNγentgroupsparedodelgroups(P0.05).ConclusionShenqiinjectionmaydirectlykillthetumorcellsbyincreasingthecellularimmunologicfunctionorimprovingtheantitumorimmunologicfunctionintumorbearingmice.　　KEYTT)，瑞士Fluka公司；刀豆蛋白(ConA)，美国Sigma公司；DJ5031酶联免疫检测仪，华东电子集团医疗装备有限责任公司。 　　1.3方法　　1.3.1动物分组、造模、给药将ICR小鼠随机平均分为5组：H22肝癌实体瘤模型组，高、中、低剂量SQI实验组和正常对照组，每组10只小鼠，雌雄各半。模型组和3个SQI实验组小鼠腋下接种H22肝癌实体瘤细胞悬液(2×107/mL)0.2mL。24h后，高、中、低剂量SQI实验组小鼠分别腹腔注射给予参芪注射液12、6、3g生药/kg。模型组和正常对照组小鼠腹腔给予氯化钠注射液0.2mL。连续给药10d。　　1.3.2抑瘤率的测定给药10d后处死小鼠，剥瘤称量，计算各组肿瘤生长抑制率(抑瘤率，IR)。IR=(模型组平均瘤重量实验组平均瘤重量)/模型组平均瘤重量×100%　　1.3.3腹腔巨噬细胞功能的测定小鼠分组、造模及给药方法同上。给药10d后，测定各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数[1]。　　1.3.4脾脏淋巴细胞增殖指数小鼠分组、造模及给药方法同上。给药10d后断颈处死小鼠，摘取脾脏，MTT法测定各组小鼠脾淋巴细胞转化指数[2]。　　1.3.5血清IL2和IFNγ的含量测定小鼠分组、造模及给药方法同上。给药10d后，采血分离血清，严格按试剂盒说明书测定各组小鼠血清IL2和IFNγ 的含量。　　1.3.6统计学处理使用SPSS10.0版统计软件进行数据处理，计量资料用±s表示，组间比较采用方差分析(OneWayANOVA)，方差齐时选用LSD(LeastSignificantDifference)法，方差不齐时选用Dunts法，显著性水准设为P0.05。　　2结果　　2.1各组小鼠H22瘤重及抑瘤率SQI高、中剂量实验组小鼠H22肝癌实体瘤瘤重与模型组比较明显减轻，差异显著(P0.05，表1)。　　表1各组小鼠H22瘤重及抑瘤率（略）　　Table1H22tumoriceineachgroup　　*P0.05vs.modelgroup;IR:inhibitoryrate　　2.2各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数及脾淋巴细胞增殖指数模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数和腺淋巴细胞增殖指数均显著低于正常对照组小鼠(P0.05)。高、中剂量SQI实验组荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数显著高于模型组小鼠(P0.05)。三个剂量SQI实验组小鼠脾淋巴细胞增殖指数均显著高于模型组(P0.05，表2)。　　2.3各组小鼠血清IL2、IFNγ的含量模型组小鼠血清IL2、IFNγ 含量显著低于正常对照组小鼠(P0.05)，高、中剂量SQI实验组小鼠血清IL2、IFNγ明显高于模型组小鼠(P0.05，表3)。　　表2各组小鼠巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数及脾淋巴细胞增殖指数（略）　　Table2Percentageofmacrophage,indexofphagocytosisandspleenlymphocytemultiplicationindexofthemiceineachgroup　　*P0.05vs.modelgroup　　3讨论　　针对肿瘤以及病毒感染等，细胞免疫是机体的重要防御因素。机体细胞免疫功能状态，尤其是机体的抗肿瘤免疫水平在肿瘤的发生及发展过程中发挥着及其重要的作用[3]。单核巨噬细胞系统是机体保持内环境稳定的一个最重要系统，广泛参与免疫应答、免疫效应和免疫调节。巨噬细胞的吞噬功能是衡量机体细胞免疫水平的一个重要标志，是机体细胞免疫清除突变细胞、抑瘤抗瘤的重要因素。T淋巴细胞是介导机体细胞免疫的免疫活性细胞，在免疫应答全过程中起着重要的调节、效应作用。但淋巴细胞只有转化为淋巴母细胞才能发挥免疫调节作用，T淋巴细胞转化率(增殖指数)的高低直接反映机体细胞免疫的水平。IL2主要是由Th1细胞产生的一种具有免疫调节作用的多肽类激素。IL 2能促进相应靶细胞增殖，支持T细胞的持续产生，活化NK细胞。IL2主要通过诱导生成淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)，诱导IL2、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)的产生，并通过直接的细胞接触增强细胞毒活性等在抗肿瘤免疫中发挥作用[45]。IFNγ是机体受病毒或其他IFN诱生剂刺激，由辅助性T细胞产生的活性糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能。IFNγ通过抑制肿瘤细胞的增生，改变肿瘤细胞表面的性能及诱发新的抗原而被免疫监视细胞识别并加以排斥，实现抗肿瘤效应和增强机体抗肿瘤能力。另外，IFNγ还可以促进其他细胞因子的抗肿瘤作用[6]。小鼠H22肝癌实体瘤是抗肿瘤药物研究中常用的动物移植性肿瘤模型。本实验利用此模型观察了参芪注射液的体内抑瘤作用，结果表明参芪注射液对小鼠H22肝癌实体瘤的生长有明显的抑制作用，抑瘤率达60%以上。在本实验中我们发现，小鼠在接种了H22后，腹腔巨噬细胞的吞噬功能、脾淋巴细胞的增殖指数、血清IL2和IFNγ 含量均显著低于正常对照小鼠，说明小鼠接种肿瘤细胞后，机体的细胞免疫功能被抑制。这是因为肿瘤细胞分泌的可溶性免疫抑制因子诱导免疫抑制细胞活化，进一步削弱了机体整体的免疫功能。该结果与临床上肿瘤患者多表现不同程度的免疫功能减弱是一致的。机体免疫功能抑制或紊乱，使肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的杀伤作用，有利于肿瘤的发生和发展。现代药理学研究表明，人参和黄芪均能不同程度地提高和调节机体的免疫功能，其活性成分为皂甙和多糖。多糖作为生物效应调节剂可影响网状内皮系统、外周血T淋巴细胞、NK细胞及巨噬细胞，并影响补体的形成以及细胞因子的分泌。人参的活性成份Rg1在体内或体外均能促进淋巴细胞增殖，促进IL2基因和IL2R表达，从而促进IL2的合成和释放。研究表明中药及其有效成分能够通过诱导机体产生IFNγ来增强其抗肿瘤和免疫调节功能。黄芪多糖、刺五加多糖、茯苓多糖、人参等能均诱导IFNγ的产生。此外，中药皂甙和多糖还具有抗肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管形成等生物活性，能够直接杀伤肿瘤细胞。以往的研究也发现，诸多中药活性成分对肿瘤细胞的直接杀伤作用具有明显的时间和剂量依赖性，有效抑瘤浓度在体内应用就有很强的细胞毒性作用。而动物实验的结果表明，中药的活性成分在体内远小于其有效抑瘤浓度时即可发挥明显的抑瘤作用。这些研究结果提示，中药活性成分之所以在体内有良好的抑瘤作用，不是仅依靠对肿瘤细胞的直接杀伤作用，还与其能提高机体细胞免疫水平，改善抗肿瘤免疫状态有密切关系[79]。在本实验中，参芪注射液对荷瘤小鼠巨噬细胞、T淋巴细胞数量的提升和活化，对血清IL2和IFNγ 含量的提升作用显著，表明参芪注射液能够改善和提高荷瘤鼠细胞免疫功能，发挥免疫调节和抑瘤效应。在诸多中药活性成分的共同作用下，通过对巨噬细胞、T淋巴细胞功能的改善，进一步促进了IL2分泌，继而通过IL2的生物学效能，广泛参与机体免疫反应的调控。参芪注射液中所含的中药活性成分可能首先诱导Th1细胞分泌高水平的IL2，进而活化NK细胞、巨噬细胞，促进这些对肿瘤细胞的杀伤作用。也可能是直接刺激巨噬细胞活化，通过活化的巨噬细胞分泌高水平的非特异性免疫效应分子，再进一步活化非特异性杀伤细胞对肿瘤细胞的作用。其作用环节有待进一步研究。肿瘤患者的免疫功能受到抑制，尤其是晚期肿瘤患者在经过长期化疗/放疗后，免疫功能低下尤为明显。由于机体免疫功能状态与肿瘤的发病及预后密切相关，因此，改善机体免疫状态，尤其是提高细胞免疫功能已成为肿瘤防治中不可忽视的环节。中药具有药源充足、疗效显著、毒副作用小及不易产生耐药性等优点，具有广阔的应用前景。【