白藜芦醇通过线粒体途径减轻大鼠重症急性胰腺炎肺损伤

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1、白藜芦醇通过线粒体途径减轻大鼠重症急性胰腺炎肺损伤作者：沙焕臣，拉吉姆，马清涌，徐复国，马振华【摘要】目的：探讨白藜芦醇(RES)对实验性重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺损伤的保护作用及其机制.方法：32只成年雄性SD大鼠随机分为假手术(SO)组；SAP组；地塞米松(DEX)组和RES治疗组.各组大鼠在制模后12h采集标本.动脉血气分析检测动脉血氧分压（PaO2）；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清TNFα和IL6含量；透射电镜(TEM)观察肺脏超微结构变化；RTPCR检测凋亡调控基因Bax,Bcl2和Caspase3mRNA表达；镜下观察结果显示，SAP组肺组织明显充血肿胀

2、，并可见大量炎细胞浸润和细胞凋亡，线粒体肿胀明显；RES组肺组织病理损害程度较SAP组减轻；PCR结果显示，SAP组凋亡调控基因Bax,Caspase3mRNA表达较SO组明显升高，Bcl2mRNA表达降低，RES组Bcl2mRNA表达较SAP组升高(P<0.05)，Bax,Caspase3mRNA表达较SO组明显降低，a公司）；RES（西安奥塞斯生物有限公司）；TNFα，IL6ELISA检测试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）；PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；凋亡调控蛋白Bax，Bcl2，Caspase3，细胞色素c（

3、Cytochromec,Cytc）mAb（美国SantaCruz生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ⅱ抗、小鼠抗βactinmAb（北京博奥森生物技术有限公司）；线粒体提取试剂盒（上海杰美生基因医药科技有限公司）；增强化学发光剂(美国Pierce生物技术有限公司)；透射电镜（日本东芝公司）.1.2方法1.2.1动物分组及SAP模型建立将32只大鼠随机分为假手术（SO）组、SAP组、RES治疗组和地塞米松（dexamethasone,DEX）组，每组动物8只.大鼠禁食12h，禁水4h，25g/L戊巴比妥钠（1.2mg/kg）腹腔注射麻醉.动脉夹夹闭胰胆管近端和远端，40g/L

4、牛磺胆酸钠（1mL/kg）经胰胆管逆行注射建立SAP模型，注射时间保持1min，拔出穿刺针，取出动脉夹.SO组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁，胰胆管内不注射任何药物；在建立SAP模型后，经阴茎背静脉RES组立即注射RES10mg/kg；DEX组立即注射DEX0.5mg/kg.大鼠在制模后12h剖杀取材.1.2.2大鼠腹水计量和死亡率记录在取材前先打开大鼠腹壁，以10mL无菌注射器收集大鼠腹水并计量.大鼠死亡率计算方法为未到12h死亡的大鼠从本组中排除，另选大鼠补齐，以死亡的大鼠数量和总计应用的大鼠数量比值计算大鼠死亡率.1.2.3动脉血PaO2检测在大鼠剖杀前从腹主动脉取血0.5mL,应

5、用iSTAT全自动血气分析仪检测各组大鼠动脉血气分析.1.2.4血浆TNFα和IL6ELISA检测应用ELISA检测试剂盒检测大鼠血浆中TNFα和IL6含量，详细步骤严格按照试剂盒说明书进行操作.1.2.5肺组织和胰腺组织的病理学观察肺组织和胰腺组织40g/L多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察胰腺组织病理学改变.另取肺脏和胰腺组织1mm×1mm×1mm以25g/L戊二醛4℃固定8h，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon812浸透，LKBV型超薄切片机进行超薄切片（50~70nm），电镜下观察肺和胰腺组织超微结构改变.1.2.6肺组织总RNA提取及RTPCR用T

6、rizol试剂提取肺组织中的总RNA，测定260nm/280nm的A值，计算RNA浓度.取RNA2μL，用RT试剂盒合成cDNA链.再以逆转录反应液2μL作为模板，PCR试剂盒进行扩增.PCR反应条件为：变性94℃30s，退火55℃45s,延伸72℃1min，共30个循环；72℃延伸10min终止反应.扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影.检测指标为凋亡调控基因Bax，Bcl2和Caspase3，以βActin作为内参照.Bax引物序列为：上游5′TCCAGGATCGAGCAGA3′，下游5′AAGTAGAAGAGGGCAACC3′(256bp)；Bcl

7、2引物序列为：上游5′CTGGTGGACAACATCGCTCTG3′，下游5′GGTCTGCTGACCTCACTTGTG3′(228bp)；Caspase3引物序列为：上游5′GGAGCTGGACTGTGGCATTGA3′，下游5′CAGTTCTTTCGTGAGCATGGA3′（232bp）内参照βActin序列为：上游5′ATTGTAACCAACTGGGACG3′，下游5′TTGCCGATAGTGATG