宫内缺氧对幼年大鼠大脑齿状回颗粒细胞及其记忆功能的影响及当归的干预作用

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1、宫内缺氧对幼年大鼠大脑齿状回颗粒细胞及其记忆功能的影响及当归的干预作用作者：钟小明，钟梅，刘跃梅，余鸿【摘要】　　目的探讨宫内缺氧对生后幼年大鼠齿状回颗粒细胞及其学习能力的影响和当归的干预。方法将孕14d大鼠置于三气培养箱内缺氧，当归组在缺氧前注射当归注射液；缺氧组注射生理盐水；对照组注射生理盐水，但不缺氧；待自然生产，产后30d各组随机取幼鼠行Morris水迷宫实验，实验后取脑组织，行神经元特异烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色。结果水迷宫实验各组大鼠在目标象限的搜索时间比较：缺氧组＜对照组（P＜0.05）；缺氧组＜当归组（P＜0.05）；积分光密度（

2、IOD）均数比较：缺氧组＜对照组（P＜0.05）；缺氧组＜当归组（P＜0.05）。结论宫内缺氧能损伤齿状回颗粒细胞并降低大鼠的记忆能力;当归注射液能减轻宫内缺氧对齿状回颗粒细胞的损伤，增强缺氧大鼠的记忆能力。【关键词】宫中缺氧当归注射液齿状回颗粒细胞记忆能力　　宫内缺氧是临床上的常见症，缺氧对胎儿生长发育可产生严重影响，尤其对神经系统影响。神经系统在胚胎发育中出现最早，且对缺氧非常敏感；缺氧可导致如癫痫、脑瘫、痴呆等的严重后遗症，因此研究宫内缺氧对神经系统的影响具有重要的临床意义。为此，本实验通过建立大鼠宫内缺氧动物模型，采用免疫组织化学法检测NSE在缺

3、氧大鼠齿状回中的表达及采用Morris水迷宫检测缺氧大鼠的记忆能力，探讨宫内缺氧大鼠在组织学和行为学上的变化及当归的干预作用，为临床研究宫内缺氧对神经系统的长期影响及评估当归的药用价值提供理论基础。　　1材料与仪器　　1.1动物　　孕SD大鼠20只，由泸州医学院动物实验中心提供，一级实验动物（许可证号：川实动管质第17号）。　　1.2仪器和试剂　　NSE抗体、SABC试剂、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；三气培养箱（美国REVCOPANY）；自动切片机（LEicaRM2245）；Ax07TRF-A荧光显微成像系统（Olympus）；Ima

4、ge-ProPlus5.1图象分析系统（MediaCybericspany）；250g/L当归注射液（武汉大学中南医院批号：060926）。　　2方法　　2.1建立模型将孕14d的SD鼠随机分为对照组12只、缺氧组12只、当归组15只，缺氧组和当归组孕鼠置于三气培养箱内缺氧（O2浓度体积分数：130ml/L，温度：25℃），缺氧2h/d，连续缺氧3d，制作缺氧性脑损伤新生鼠模型，当归组孕鼠在缺氧前1h经尾静脉注射250g/L当归注射液（8ml/kg），注射7d,缺氧组孕大鼠经尾静脉注射生理盐水（8ml/kg），其余干预措施同治疗组；对照组只注射生理盐水，

5、但不缺氧；待自然生产，生后喂养至第30天。　　2.2Morris水迷宫实验各组随机取大鼠（对照组12只，缺氧组12只，治疗组15只）行Morris水迷宫实验，在前几次训练中，如果时间超过60s，则引导大鼠到平台，让大鼠在平台上停留10s。连续训练5d，阶段训练4次/d，间隔15min/次，第6天进行60s的探查实验；在整个水迷宫实验的过程中，每天均保持实验室的光线、环境布局不变。　　2.3免疫组织化学水迷宫实验结束后立即取幼年大鼠脑组织，经固定、脱水、浸蜡、包埋，经海马冠状切面切片（片厚4μm），切片脱蜡至水。行NSE（1:200）免疫组织化学染色。　　

6、2.4分析与判断方法　　用Ax07TRF-A荧光显微成像系统观察每一张切片，每张切片均以海马齿状回为观察目标，放大倍数为200倍。胞质染成棕黄色的为颗粒细胞，每例大鼠选一张切片，观察面积为：311×311像素。分析积分光密度值（IOD）和水迷宫实验大鼠在目标象限的探察时间T。采用SPSS14.0统计软件包分析，组间比较采用单因素方差分析（one-.　　3结果　　水迷宫实验缺氧组大鼠在目标象限的搜索时间比对照组搜索时间短，差异具有显著性（P＜0.05）；当归组大鼠搜索时间比缺氧组搜索时间长，差异具有显著性（P＜0.05）。　　对照组大鼠齿状回可见NSE阳性

7、表达，为棕黄色，成带状“V”或“U”字形分布；缺氧组胞体形态不规则，NSE表达减弱；当归组表达增多，但仍低于对照组位于颗粒层。图像分析显示，缺氧组IOD均数比对照组相应指标减低（P＜0.05），当归组IOD均数比缺氧组相应指标增高（P＜0.05）。结果见表1。表1各组积分光密度值及搜索时间（略）　　4讨论　　胚胎宫内缺氧动物模型目前比较成功的有两种：一种是Bjelke法［1］，该法就是先对孕鼠进行药物麻醉，后通过夹闭血管的方法来制作缺氧模型。然而，麻醉药物、剖腹手术可增加对孕鼠和胎鼠新的干扰因素，尤其是对胚胎神经系统的影响不容低估。另一种是余鸿等［2］制

8、作的低张性宫内缺氧模型。本实验在余鸿等研制的宫内缺氧模型的基础上，采用了智能型三