改良的mtt96孔板微量二倍稀释法测定大黄对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用

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1、改良的MTT96孔板微量二倍稀释法测定大黄对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用何苗陈红斌刘衡（人理学院云南省药用昆虫工程实验室云南人理671000）【摘要】本文用改良的MTT96孔板微量二倍稀释法测定大黄游离蒽醌对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用。【关键词】MTT大黄痤疮丙酸杆菌抑菌【屮图分类号1R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）15-0186-01痤疮丙酸杆菌（Propionibacteriumacnes），也称痤疮杆菌，是造成青春痘的主要细菌。其是一种革兰染色阳性的兼性厌氧短杆菌，细胞A寄生，属于皮肤的正常菌群，一般寄居在皮肤的毛囊及皮脂

2、腺屮。随着青少年的发育成熟，毛囊门出现角栓，皮脂腺分泌功能也明显増加，因皮脂含有较多脂肪酸等成分，适合其生长及繁殖，从而成为痤疮最主要的病因之一。本文旨于用一种改良的新方法测定大黄对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用。1试剂与材料1.1试验药物大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素（江苏淮安市巍伟植化研究所）、大黄总游离蔥醌（自制h乳糖酸红霉素（大连美罗大药厂），克林霉素（北京四环科宝制药有限公司），青霉素钠（华北制药有限公司），氯化三苯四氮唑（TTC,上海试剂三厂）。1.2试验菌株痤疮丙酸杆菌标准菌株（复旦大学医学院病原生物室）。1.3仪器及试剂生化培养箱

3、、96孔板、光学显微镜（Olympus）、可调式移液枪、硫乙醇酸盐培养基(卫生部上海生物制品研究所)。1.4方法1.4.1培养基及供试药液的制备硫乙醇酸盐培养基：按说明书方法配制，调pH值为7左右。将培养基密封后经121°C高压火菌30min,冷却后，置于冰箱中(4°C)保存备用。在上述培养基基础上添加1.5%的琼脂灭菌，自然冷却，待培养基温度降到45〜50°C左右的时候，以无菌操作按10%加入7%无菌脱纤维兔血于培养基中，轻轻摇匀，置于冰箱中(4°C＞保存备用。大黄游离蔥醌供试药液配制：分别称取一定量的游离蔥醌，以DMF作为溶剂，在超净台上用二倍稀释法将各

4、药物配成0.1〜6.4mg/mL浓度的供试药液，密封，常温贮存备用。阳性药物：称取乳糖酸红霉素、克林霉素、青霉素同法在超净台下取一定量的药物用无菌水配制药物溶液。1.4.2菌悬液的制备将痤疮丙酸杆菌菌株接种培养增菌，用液体石蜡隔绝空气，于37°C培养箱中培养，取活化18h的上述菌液适量，用培养基稀释，将浊度调整到0.5麦氏比浊标准(约为1.5×108CFU/mL),再用培养基稀释，用血球计数板将悬液调整到l×107〜5×107CFU/mL，作为痺疮丙酸杆菌悬液，备用。1.4.3药敏试验将供试药液进行一定梯度的稀释，用移液枪

5、将10μL不同浓度的供试药液分别加入96孔微量板中；阴性对照为DMF;空白对照为液体培养基。均再加入180μL的液体培养基，10μL菌悬液，每孔总体积为200μL，最后用10μL的液体石蜡瞞绝空气，在规定的温度下在普通培养箱中培养18〜24h,观察结果。1.5最低抑菌浓度(MIC)的评定由于丙酸杆菌属的细菌在代谢发酵过程中能产生大量有机酸［1】，一般使用甲基橙来判定丙酸杆菌是否生长。在本研宄中，改用氯化三苯四氮唑(TTC)辅助观察96孔板中痤疮丙酸杆菌的生长情况一一TTC试验阳性结果(产生红色)，则说明药敏实验管的痤疮丙酸杆菌生

6、长良好；阴性结果(无色)，则说明药敏试验管中痤疮丙酸杆菌的生长代谢受到抑制，即药敏试验管中的药物浓度达到MIC或MIC以上，比甲基橙更直观、准确。将96孔板在规定的温度下培养18〜24h后，每孔加入0.25%TTC5μL,继续培养2h。重复6次。用肉眼和倒置显微镜观察培养孔，呈现红色为有细菌生长，在阴性对照和空白对照的前提下，判断供试样品是否具有抗菌活性。记录结果。2试验结果所有空白对照和阴性对照孔均呈现红色,说明药物溶剂1%DMF溶液无干扰，不影响试验结果。乳糖酸红霉素、克林霉素、青霉素对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.02μg/

7、mL、0.01μg/mL及0.01μg/mL,均在CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准范围内［2】，说明该试验方法具有可靠性。在大黄的五种游离蒽醌中，大黄素对痤疮丙酸杆菌的抑制作用最强，其MIC为8μg/mL,大黄酸和游离蔥醌的MIC为32μg/mL,芦荟大黄素的MIC为16μg/mL,大黄酚和大黄素甲醚在供试浓度范围内没有抑菌活性，见表1。表1游离蔥醌作用下痤疮丙酸杆菌的生长情况注：表示细菌不生长，“+”表示细菌生长3讨论用氯化三苯四氮唑(TTC)判定MIC,原理为TTC可被活菌细胞内的琥珀酸脱氢酶等呼吸酶，还原成不溶性的红

8、色甲赞颗粒，使活菌落呈现红色［3］,从而可以准确地鉴