痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血中树突状细胞（dc）的动员在体外对胃癌细胞的作用

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1、痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血中树突状细胞（DC）的动员在体外对胃癌细胞的作用（河北省沧州市屮西医结合医院河北沧州061000）【摘要】目的：探讨痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血屮树突状细胞（DC）的动员在体外对胃癌细胞的作用。方法：C578Bl7L6j（B6）小鼠注射痤疮丙酸杆菌后分离外周单核细胞，予以流式细胞仪将F4/80-B220-CD11C+细胞，体外加入TNF-α>IL-4、GM-CSF等细胞因子培养，由混合淋巴细胞反应、表型分析、形态学观察鉴定其能否分化为成熟DC;将痤疮丙酸杆菌动员的树突状细胞负载H癌

2、抗原后致敏细胞，观察体外t细胞活化后对H癌细胞的杀伤效应。结果：实验组注射痤疮丙酸杆菌后lh、6h、Id、2d、3d、5d、7d后小鼠外周血屮F4/80-B220-CDC+细胞变化显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），实验组第Id后显著升高，第3天达高峰后逐渐降低；H癌细胞与B16细胞相比，痤疮丙酸杆菌动贝的DC活化的T细胞及骨髓來源的DC活化的T细胞屮IFN-γ干扰素的分泌水平差异有统计学意义（P<0.05）。结论：痤疮丙酸杆菌可对F4/80-B220-CD11C+细胞迅速动仍进

3、入小鼠外周血，细胞因子诱导后口J分化为成熟的树突状细胞，体外诱导特异性T淋巴细胞系伤胃癌细胞，同时合并分泌大量INF-γ。【关键词】实验研究；胃癌；树突状细胞；痤疮丙酸杆菌【中图分类号】R735.2【文献标识码】B【文章编号】1003-5028（2015）7-0230-02胃癌在我国各种恶性肿瘤屮居首位，胃癌除进行化疗及手术外，近年來认为对胃癌患者进行肿瘤免疫治疗临床效果较佳，而其屮主要为痤疮丙酸杆菌动员外周血屮的树突状细胞，对肿瘤细胞产生系伤效应，效果确切［1-2］。探析痤疮丙酸杆菌促进小鼠外周血屮树突

4、状细胞的动贝效应具有重要的临床价值，故本研究探究痤疮丙酸杆菌（p.acnes）促进小鼠外周血屮树突状细胞（DC）的动员在体外对胃癌细胞的作用，效果满意，现报道如下。1资料和方法1.1实验动物中科院实验动物中心上海分中心提供8-10周龄的雌性BALB/c小鼠及C578BL/6J(B6)鼠。1.2主要实验仪器及试剂美国BD公司提供的鼠TNF-α、IL-4、GM-CSF、重组鼠干细胞因子(SCF),中科院上海细胞所提供的黑色素瘤B16细胞株及胃癌细胞株SCG-7901,美国Pharmigen公司生产的PE标记的

5、抗la、CD8αNCD86单抗、FITC标i己的抗CDllb、CD80、F4/80、CD40单抗，FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，鼠DEC-205单抗，异硫氰酸荧光素标记的CDlc单抗，藻红元荧光素(PE)标记的B220单抗，生物素标记的Cy-chrome-conjugatedstreptavidin二抗及F4/80单抗;德国Miltenyi公司生产的结合鼠CD3单抗的免疫磁珠，美国Endogen公司生产的鼠γ干扰素ELISA检测试剂盒。1.2实验方法1)分离小鼠外周血F4/80-B220-C

6、D11C+细胞:B6小鼠分为八组，每组5只；实验组将火活的痤疮丙酸杆菌(lmg/100μIPBS)由尾静脉注射，对照组予以PBS100μl注射，在注射前、注射lh、1、2、3、5、7d后小鼠后心脏予以乙醚麻醉，穿刺采集0.8ml外周血，肝素抗凝，外周血单个核心板予以密度梯度离心法分离，细胞标记后由流式细胞仪进行F4/80-B220-CD11C+细胞分离，纯度超过99%;2)观察及表型分析F4/80-B220-CD1C+细胞的形态学：选择注射痤疮丙酸杆菌24h后分选的F4/80-B220-CD1C+细胞，在

7、24孔培养板上接种，加入10ng/mllL-4及4ng/mlGM-CSF,培养五天后更换新培养板，后用50ng/mlTNF-α及4ng/mlGM-CSF培养五天；培养吋每隔2日予以培养基半量换液，用非特异性酯酶和Giemsa染色后光镜下观察；取分选的F4/80-B220-CD1C+细胞，标记后予以流式细胞仪检测共刺激分子DEC205、CD86、CD80及MHC-II。3)混合淋巴细胞反应(MLR):采集BALB/c小鼠脾脏细胞，应用密度梯度离心法分离MNCs,将结合鼠CD3单抗的磁珠加入后分选，注射痤疮丙

8、酸杆菌24h后的F4/80-B220-CD11C+细胞，将细胞因子及丝裂霉素C(MMC)做相M处理后备用。将刺激细胞及反应T细胞加入96孔板，同吋设置单一细胞对照。培养五天后每孔加入MTT继续培养4h离心后除去上清液，加入异丙醇55nm酶标仪检测0D值;4)T效应细胞的诱导、检测IFN-γ：冻融3次的肿瘤细胞悬液离心后，上清液做可溶