差异基因研究技术及其应用

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1、差异基因研究技术及其应用【关键词】,差异表达基因；差异显示PCR方法；消减杂交法　　［摘要］差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制，从而探索疾病治疗的有效方法。随着分子生物学技术的发展，各种研究差异表达基因的方法应运而生，尽管每种方法都有其缺陷和不足之处，但毕竟为我们提供了切实可行的研究方法，现就目前的主要研究技术做一综述。　　［关键词］差异表达基因；差异显示PCR方法；消减杂交法　　Technologyondifferentialgeneanditsapplication　　［Abstract］Differentialexpressiongen

2、eisrelatedtothediseases.Tostudythesegenesdeeplymaycontributetoexposethepathogenesisofdiseasesingenelevelandexploretheeffectivemethodstocurethediseases.idorikaRNA为模板，用生物素标记的Oligo（dT）为引物合成双链cDNA，以限制酶进行酶切，捕获cDNA3′端；产物被分为两部分，分别与包含有标签内切酶位点的A、B连接子相接。经过酶切，就有可能得到只有9~10bp的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为PCR的模板，以

3、基于A、B连接子的引物进行PCR反应的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标签的序列，接下来再用限制酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起，克隆至质粒载体中后集中测序。SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，系统地分析基因表达的差异。Cornelissen等［5］运用该技术，从艾滋病相关Kaposi’s肉瘤的基因表达谱获得64个表达显著上调的基因，28个表达下调的基因。Urschitz等［6］应用该技术研究了晒伤皮肤的基因差异，明确表皮在晒伤皮肤的发病中发挥主要作用。SAGE技术的缺点在于工作量大，有大量的测序及计算机分析任务；对于寻找新基因而言，仅用长度为

4、13bp的寡核苷酸探针筛选cDNA文库导致假阳性结果居多。　　3差异显示PCR方法（differentialdisplayPCR,DD-PCR）　　利用可以扩增所有哺乳类mRNA的几条5′特定引物和几条3′锚定引物随机组合，将cDNA进行PCR扩增，这样对于相同的cDNA，PCR产物的种类多少和分布应该是完全一样的，而对于不同的cDNA则可以找到差异条带，它们所代表的cDNA就有可能与细胞状态的改变或疾病状态相关。　　差异显示PCR方法具有快速、所需RNA量少、可同时显示多种生物性状的差异及可以同时获得高表达和低表达的基因等诸多优点；但假阳性率高，可高达70%的假阳性条带［

5、7］；不能反映低拷贝mRNA的差异，对高拷贝基因有偏向性；获得的片段多为300bp左右的3′非编码区，很难判断其功能和意义，只能提供研究线索。　　哺乳动物的创伤愈合常需要数周至数月时间，伴有瘢痕形成且机制不明，MRL/MPJ（MRL）鼠具有无瘢痕愈合的能力，Masinde等［8］采用差异显示PCR方法研究了参与MRL/MPJ（MRL）鼠无瘢痕创伤愈合的基因，鉴定了36个与创伤愈合有关的差异表达基因，为无瘢痕创伤愈合的研究提供了靶基因。　　4消减杂交法（SH）　　经典的消减杂交法是将实验组mRNA（或cDNA）与对照组cDNA（或mRNA）杂交，去除杂交体和未杂交上的对照组成

6、分（cDNA或mRNA），得到实验组独有的cDNA或mRNA，这些基因即为差异表达基因。为克服传统的消减杂交法的不足，新的消减杂交技术应运而生。　　4.1代表性差异分析技术（RDA）原理是首先用DpnⅡ或Sau3AI酶切两组双链cDNA，两端接上单链接头R，补平后，用含接头R序列的引物扩增，再用DpnII或Sau3AI去除双链cDNA两端的接头R；只给予实验组双链cDNA两端再接上单链接头J。将实验组与驱动组cDNA杂交，杂交反应体系中只有实验组自身杂交形成的双链cDNA才两端都带接头J，补平后可被含有接头J序列的引物几何级扩增，而只有一端带接头J的杂交体只能被线性扩增。将

7、此杂交产物再进行第二轮酶切、加接头、杂交和PCR扩增，重复两次后，可确保从实验组中彻底去除与驱动组共有的序列。　　其优势为：（1）高效性，与传统的消减富集相比，更加敏感，可以筛选出低拷贝的差异基因；（2）可靠性，结果重复性好，假阳性率非常低。Chang等［9］结合cDNA-RDA和膜杂交筛选，对比正常人口腔黏膜上皮和HPV永生化的口腔上皮细胞系，获得了384个差异表达的克隆，并证实其中含69种差异基因。　　cDNA-RDA技术的局限性在于：（1）得到的差异片段是平均为300~600bp的小片段。（2）由于cDNA较