差异基因研究技术及其应用

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1、差异基因研究技术及其应用【关键词】,差异表达基因；差异显示PCR方法；消减杂交法　　［摘要］差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制，从而探索疾病治疗的有效方法。随着分子生物学技术的发展，各种研究差异表达基因的方法应运而生，尽管每种方法都有其缺陷和不足之处，但毕竟为我们提供了切实可行的研究方法，现就目前的主要研究技术做一综述。　　［关键词］差异表达基因；差异显示PCR方法；消减杂交法　　Technologyondifferentialgeneanditsapplication　　［Abstract］Differentiale

2、xpressiongeneisrelatedtothediseases.Tostudythesegenesdeeplymaycontributetoexposethepathogenesisofdiseasesingenelevelandexploretheeffectivemethodstocurethediseases.Withthedevelopmentofmolecularbiology,allkindsoftechnologyappearedtostudydifferentialexpressiongene.Althoughitslimit

3、ation,thesemethodsprovidethefeasibletechnologytostudydifferentialexpressiongene.Thearticlereviewedthemajortechnologyofdifferentialexpressiongene.11　　［Keywords］Differentialexpressiongene;differentialdisplayPCR;subtractivehybridization　　在高等生物个体发育中，不同组织细胞在不同时期的基因表达按照时间和空间顺序有序地进行，称

4、之为基因的差异表达；那些异常表达的基因可能直接或间接关系到疾病的发生和易感性。筛选和鉴定这些差异表达的基因对于从基因水平揭示疾病的发生机制，探索疾病治疗的有效方法具有重要意义。现就目前研究差异表达基因的主要方法及其原理分述如下。　　1cDNA微阵列技术（cDNAmicroarrayhybridization）　　该技术是指在固相支持物上直接将大量已知序列的探针有序固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，杂交信号阳性的探针序列就是在组织或细胞中表达的DNA序列。cDNA微阵列技术具有商品化的芯片，DNA样品形成致密的微集阵列，其集成度可达2万个点阵/c

5、m2［1］。该技术可用于大规模筛选差异表达基因。Midorikawa等［2］为了阐明雄激素脱发患者脱发区和未受累部位毛乳头细胞基因表达谱的差异，通过该技术筛选到107个差异表达基因；其中BMP2和ephrinA3的基因表达显著下调，因此认为BMP2和ephrin11A3在毛发周期中具有促进毛发生长的作用。该技术用于疾病诊断和药物疗效评价，用于诊断是否携带艾滋病病毒［3］的基因芯片已经问世；有学者［4］应用该技术评估咪喹莫特治疗HPV2/27/57引起的生殖器疣，明确了咪喹莫特对生殖器疣的治疗作用。尽管该技术具有良好的应用前景，但目前序列确认的人类cD

6、NA克隆还相当缺乏，在一定程度上局限了DNA芯片技术的发展；基因芯片造价很高，目前只有大制药公司和研究所能承受，这些都限制了其应用范围。　　2基因表达系统分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）　　SAGE其原理是以mRNA为模板，用生物素标记的Oligo（dT）为引物合成双链cDNA，以限制酶进行酶切，捕获cDNA3′端；产物被分为两部分，分别与包含有标签内切酶位点的A、B连接子相接。经过酶切，就有可能得到只有9~10bp的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为PCR的模板，以基于A、B连接子的引物进行PCR反应

7、的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标签的序列，接下来再用限制酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起，克隆至质粒载体中后集中测序。SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，系统地分析基因表达的差异。Cornelissen等［5］运用该技术，从艾滋病相关Kaposi’11s肉瘤的基因表达谱获得64个表达显著上调的基因，28个表达下调的基因。Urschitz等［6］应用该技术研究了晒伤皮肤的基因差异，明确表皮在晒伤皮肤的发病中发挥主要作用。SAGE技术的缺点在于工作量大，有大量的测序及计算机分析任务；对于寻找新基因而言，仅用长度为13bp

8、的寡核苷酸探针筛选cDNA文库导致假阳性结果居多。　　3差异显示PCR方法（differentialdisp