交联温度对京尼平交联胶原-壳聚糖组织工程支架的影响

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1、交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖组织工程支架的影响.L.编辑。作者：曹峥，胡蕴玉，潘纬敏，白雪东，毕龙，李丹，杨小彬，刘民【摘要】[目的]通过研究材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响。[方法]采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架，分别于4℃、20℃、36℃条件下，在0.5%京尼平水溶液中交联24h。以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照，评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性特点。[结果]随交联温度升高，支架的

2、交联度明显增大，溶胀率和降解率逐渐减小。4℃组支架交联度47.88%±6.4%，溶胀率为721%±46%，4周后降解3.95%±6.4%;20℃组支架交联度67.69%±3.6%，溶胀率为662%±72%，4周降解0.91%±5.9%;36℃组支架交联度70.32%±5.7%，溶胀率为635%±27%，4周降解0.66%±7.3%，三组上述观察指标均优于未交联组(P/0.01)。[结论]京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率，且对支架结构和生物相容性无明显影响。交联温度增加可以提高支架的交联度和抗降解能

3、力，较快获得具有良好生物相容性和降解率的组织工程支架。【关键词】交联温度;壳聚糖;胶原;京尼平;组织工程　　Abstract:[Objective]Toinvestigatethechangesofporesizes,crosslinkingindex,speraturepoints.[Method]Thefreeze-driedcollgaen/chitosanscaffoldscrosslinkedperature:4℃group,20℃groupand36℃group.Thecharacteristicsofpo

4、resizes,crosslinkingindex,sperature,crosslinkingindexuchbetterthanthoseofcontrolgroup(P<0.01).[Conclusion]Itperatureperature;chitosan;collagen;genipin;tissueengineering　　胶原因其良好的组织相容性和可降解性被广泛用于组织工程研发领域。但由于其机械强度不足，在体内水解过程中不能保持空间构型，且吸收过快，因此，在应用时常加入壳聚糖等成分，以提高支架的弹

5、性模量、临界形变和强度[1]。交联可进一步提高支架的机械强度和抗蛋白酶降解的能力。但物理交联法交联度较低且不均一，而化学交联法采用戊二醛、甲醛等传统的交联剂，易引起中毒或不良反应。　　京尼平是一种提取自栀子果实的天然交联剂，其毒性远远低于传统的化学交联剂。细胞实验表明其毒性低于戊二醛104倍，而细胞增殖能力高于戊二醛组5×103倍[2]。但是既往对于京尼平的研究多集中于单一材料，且多关注交联时间及交联剂浓度对于材料交联的影响，而观察交联温度对京尼平交联复合支架影响的研究未见报道。本实验拟通过观察支架孔径、交联度、降解率

6、、溶胀率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖复合支架的影响。　　1材料与方法　　1.1材料与仪器　　壳聚糖(EM培养基(gibco)，胎牛血清(hyclone)，胰蛋白酶(sigma)，冷冻干燥机(CHRIST)，倒置相差显微镜(nikon)，分光光度计(HITACHl)，扫描电镜(HITACHl)。　　1.2多孔支架的制备及交联　　配制0.2mol/L的醋酸溶液，分别称取一定质量的壳聚糖和胶原粉末，将其完全溶解于稀醋酸溶液中，静置脱除溶液中的气泡。将两种溶液按一定比例混合，充分搅拌混合均

7、匀。将胶原、壳聚糖混合液注入模具中，置于冷冻柜中-20℃冷冻成型，样品完全冻结后冷冻干燥12h，制得胶原/壳聚糖复合支架。将上述支架于风箱中挥发残留醋酸后，置于0.5%的京尼平水溶液中，分别于4℃、20℃、36℃交联24h后，蒸馏水冲洗后置于饱和甘氨酸溶液中浸泡，换液至溶液不再变色后用蒸馏水反复冲洗，重新冷冻干燥。　　1.3扫描电镜观察　　将样品裁剪成直径4mm高2mm大小的小片，真空喷金后，扫描电镜观察表面结构和孔径变化，选择合适的放大倍数拍摄扫描照片。　　1.4交联度测定　　参照Mi的方法采用茚三酮法测定交联度[3

8、]。具体为：①1.05g的柠檬酸和10ml(1.0mol/L)的NaOH和0.04g的氯化亚锡(SnCl2·2H2O)混合，加去离子水调至25ml，另将1g的茚三酮加入25ml乙二醇甲醚中，再将上述两液体混合搅拌45min，制成茚三酮溶液，避光保存。②称取样品，加入4ml茚三酮溶液，100℃水浴20min，冷却至室温，加20ml5