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1、广西白裤瑶线粒体DNAHVRⅠ区多态性分析吴群英 莫小梅 黄岚珍 王凌宇 黄 江 肖福英（桂林医学院生物技术学院，广西桂林541004）【摘 要】目的:通过对白裤瑶族线粒体DNAD-LoopHVRⅠ区序列碱基的测定，了解其遗传多态性。方法:应用PCR扩增产物及直接测序法,对31名白裤瑶无血缘关系健康个体mtDNAHVRⅠ区进序列检测及分析。结果:与Anderson相应序列比对，白裤瑶群体mtDNAHVRⅠ区发现了88处突变，界定了3种单倍型，基因差异度分别为1.00,偶合概率为0.25。结论:广西白裤瑶线粒体DNAHVRⅠ区多态性有一定的本民族特点。.jyqk
2、itochondrialDNA,mtDNA)是一个由16569个碱基组成的闭合环状双链分子，由于母系遗传的特性，缺乏重组、进化速率高、群体内变异大等特点，而被广泛地应用于人类群体的起源、演化和亲缘关系以及疾病的遗传的研究。本文采用聚合酶链反应(PCR）技术及DNA测序法对广西南丹白裤瑶族mtDNAD-LoopHVRⅠ区进行了研究,为少数民族群体遗传学研究提供新的数据。1 材料与方法1.1 样本31名体检健康的白裤瑶样本均采自广西河池市南丹县，彼此间无亲缘关系，3代均为白裤瑶族，所有研究对象均知情同意。1.2 mtDNA的提取用消毒棉签刮取口腔黏膜细胞，浸泡于生
3、理盐水中，将采集口腔黏膜细胞的棉签用生理盐水把口腔细胞清洗出来于1.5mlEP管中，进行13000rpm，离心15min，小心弃去上清，然后加入200ul10％chelex100树脂，56℃水浴30min，取出后振荡5-10s,100℃水浴10min，离心3min，4℃保存，上清用于PCR扩增。1.3 HVRⅠ区的PCR扩增PCR反应总体积为50ul，引物各1umol/L,上游引物：5’-TTAACTCCACCA-TTACCACC-3’，下游引物：5’-GAGGATGGTGGTCAAGGGAC-3’（由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增片段长度为440
4、bp），2×TaqPCRMasterMix25ul,DNA模板5ul，去离子水补足50ul。反应条件：94℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后72℃延伸10min。1.4 PCR产物的检测及测序每个样品均取10μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察扩增结果；40ulPCR产物委托上海立菲生物技术有限公司进行测序。1.5 统计学分析测序结果与剑桥标准Anderson序列比较，统计变异位点及变异类型。按照公式P=∑x2(x为每个个体单倍型频率)计算偶合概率,按公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n为样本
5、含量)计算基因变异度。2 结果2.1 HVRⅠ区的PCR扩增用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小及纯度，结果表明，31例白裤瑶样本均成功扩增，扩增片段大小为440bp（见图1）。2.2 HVRⅠ区的多态性将31例白裤瑶族HVRⅠ区的PCR扩增产物测序后，所得的核苷酸序列分别与Anderson标准序列进行比较，共检测出88个突变位点，其中以碱基置换为主，包括30个碱基转换，57个碱基颠换，1个碱基缺失，1个碱基插入。碱基颠换明显高于碱基转换、插入及缺失，碱基颠换占总碱基变异的64.77％，其中A-C的颠换占总碱基变异的39.44％（见图2）。2.3 HVRⅠ
6、Ⅰ区基因变异度和偶合概率结果按照公式P=∑x2(x为每个个体单倍型频率)计算偶合概率,公式h=(1-∑x2)n/(n-1)(n为样本含量)计算基因变异度[2]。计算得出偶合概率为0.25，基因变异度分别为1.00。由此说明，广西白裤瑶族线粒体DNAHVRⅠ区具有较高的序列多态性。2.4 mtDNAHVRⅠ区14bp高变结构域Anderson序列在16180-16193位置有一个14bp富含C的高变结构域,连续9个C被16189位点的T隔开,其长度及序列因受碱基插入、缺失、转换、颠换等影响而出现个体间序列多态性,该区域也具有典型的人类学特征。本研究出现3种单倍型
7、,分别为：AAAACCCCCTCCCC(2个),AAAACCCCCTCCTC（1个),AACCCCCCCCCCCC(1个)。3 讨论线粒体DNAD-loop环区在人类学研究上是非常有价值的DNA区段,比较研究相应区段的序列间差异和变异速率,可以获得丰富的进化信息,为人类起源、进化和人群的迁移提供可靠的遗传信息。本研究选择广西白裤瑶族群体进行线粒体HVRⅠ区序列分析,研究结果表明在线粒体DNAHVRⅠ区有多个碱基突变,这表明广西白裤瑶线粒体DNAHVRⅠ区具有高度序列多态性,可以作为法医学个体识别的遗传标记。从广西白裤瑶族线粒体DNAHVRⅠ区碱基突变类型来看，
8、突变以碱基颠换为主，然而HVRⅢ区碱基
