无精症患者睾丸组织中piwi蛋白研究

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1、无精症患者睾丸组织中PIWI蛋白研究翟凌云王利权(浙江大学医学院附属第二医院妇产科310000)【摘要】目的：为了明确成年男性无精症的发生与PIWI蛋白的关系。方法:收集2014年6月份至2015年4月份于浙江大学医学院附属第二医院妇产科就诊的11例为非阻塞性无精子症患者和11例为阻塞性无精症患者的睾丸活检标木。用免疫组化的方法显示两组患者生精细胞中的PIWI1蛋白浓度差异。结果:阻塞性无精子症患者睾丸组织中PIWI1蛋白的表达明显高于非阻塞性无精子症患者，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：人

2、类男性无精症的发生与PIWI/piRNA路径有关，提示PIWI/piRNA路径可能在正常精子发育的过程中起重要的保护作用。【关键词】无精症;PIWI;piRNA;精子发育【中图分类号】R715.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2015)34-0380-02在.己婚人群中有将近10%〜15%的夫妇存在.着不孕。不孕症不但是一个家庭问题，更是一个社会问题，它严重影响了夫妇的身心健康。引起不孕的夫妇双方因素中男性因素占了将近一半。在男性因素引起的不育中，无精子症大约占了10%o为了更好的

3、了解精子发生机制，阐明睾丸精子发生的基因表达调控，从而在根木上解决无精子症患者的生殖健康问题，许多研究者进行了不懈的努力。近年来，RNA生物学倍受研究者的广泛关注，尤其是一些非编码小RNA(non-codingRNA,ncRNA)分子，这些ncRNA参与调节细胞生长和发育的重要生理过程。一类新型小分子调控RNA，因其能与PIWI亚家族蛋白结合，故命名为piRNA(PIW卜interactingRNA),通过与PIWI亚家族蛋白结合形成piRNA复合物来调控精子发生过程中的基因表达［1］。PIWI蛋白

4、质特异性地在动物生殖系细胞中表达，特异性地结合piRNA,在生殖细胞发育和配子生成过程中发挥多种重要功能［2】。遗传学研究表明生殖细胞的维护需要PIWI亚家族蛋白，以及PIWI亚家族蛋白在独特基因组位点的表遗俾激活中起作用［3】。PIWI亚家族蛋白基因敲除的雄性小鼠存在不育，表明小鼠PIWI蛋白在其精子发生过程中起重要作用［4】。本研究组旨在通过对无精子症患者睾丸生精细胞中PIWI蛋白表达量的检测，明确非阻塞性无精子症患者与阻塞性无精症患者的睾丸生精细胞中PIWI蛋白表达差异。希望阐明piRNA及其

5、PIWI蛋白在人类睾丸精子发生调控中的作用，有助于从根本上解决无精子症患者的生殖健康问题。1.方法收集2014年6月份至2015年4月份于浙江大学医学院附属第二医院生殖科就诊的22例无精症男性病人睾丸活检标本，放入液氮中保存，其中11例为非阻塞性无精子症患者，另11例为阻塞性无精症患者。利用免疫组化方法测定无精子症患者睾丸组织中PIWI1蛋白表达的水平。免疫组化结果判定标准：将两步法染色切片置于CH20型号Olympus显微镜400×下观察,胞浆或胞膜出现棕黄色为阳性。记数目标部位细胞2

6、00个以上，读出其中阴性(一)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)的细胞数。阴性(一)：细胞膜或浆内无棕黄色出现;弱阳性(+):细胞膜或浆内棕黄色着色较弱；阳性(++):细胞膜或浆内棕黄色清晰；强阳性(+++)：细胞膜或浆内奋明显棕黄色。再用组织学积分H-Score方法进行半定量分析。计算公式：H-Score=∑Pi(i+l)o其中i为染色强度，用1、2、3分别代表(+)、(++)、(+++)。Pi代表同一染色强度的阳性细胞数占待测细胞总数的百分比，即Pi=iW性细胞数×

7、;100/待测细胞总数。1为纠正系数。1.结果发现阻塞性无精子症患者睾丸组织中PIWI1蛋白的表达明显高于非阻塞性无精了症忠者，差异脊统计学意义（P<0.05）o2.讨论为了更好的了解精子发生机制，阐明睾丸精子发生的基因表达调控，从而在根本上解决无精子症患者的生殖健康问题，许多研究者进行了不懈的努力。哺乳动物PIWI/piRNA路径在蛋白编码基因的转录后的调控中起一定的作［5］。piRNA对使转座子沉默，对表观遗传的作用是肯定的［6］。但对于piRNA产生的机制，S前还没有直接的生物化学证据，一个基

8、于生物信息学分析提出逆转录转座子介导的“乒乓模型”假说得到了许多研究者的认同R】。根据与PIWI蛋白家族之间的相互关系，piRNA可分为长度为26〜28nt与29〜31nucleotides（nt）［2］，形成机制可能是相冋位点的差异剪切。但两种不冋piRNA在小鼠精子发生过程的表达也不同：（1）从精母细胞期到减数分裂的粗线期MILI均持续表达，并与26〜28nt的piRNA相结合［7］，假如在此期间内M旧产生突变，精子的发生将停滞在减数分裂粗线期［8］。（2）从粗线