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1、刺五加中紫丁香苷的提取分离及抗肿瘤作用研究论文汪琢，姜守刚，祖元刚，付玉杰，张宇【摘要】目的研究紫丁香苷的体内外抗肿瘤作用。方法应用MTT法观察紫丁香苷对体外培养的4种人癌细胞的抑制作用，构建S180实体瘤小鼠模型研究紫丁香苷的体内抗肿瘤作用。结果紫丁香苷对体外培养的4种人癌细胞有一定的抑制作用，并且能抑制小鼠S180实体瘤。结论紫丁香苷具有一定的体内外抗肿瘤活性。【关键词】紫丁香苷;提取分离;抗肿瘤作用;MTT;小鼠刺五加为五加科植物刺五加AcanthopanaxSenticosus(Puper.etMaxim)Harms的
2、干燥根及根茎,主要分布在我国的黑龙江、吉林、河北、山西、宁夏、陕西及四川等地，朝鲜、俄罗斯远东地区及日本北海道等地亦有分布和种植1。刺五加具有益气健脾、补肾安神之功效,主要用于脾肾阳虚、体虚乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多梦等病症2。此外.freela公司;BS110电子天平,美国Sartorius公司;3102型电子天平,辽宁龙腾电子有限公司;DK-8D型电热恒温热水槽,上海森信实验仪器有限公司;一次性针头式滤器,.freels公司;AV-300核磁共振波谱仪(TMS内标，300MHz)，美国Bruker公司;I1640培养
3、基,美国Hyclone公司产品;胰蛋白酶，美国Gibco公司产品;EDTA，美国Sigma公司产品;MTT(噻唑蓝)，美国Sigma公司产品;小牛血清，天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品;96孔培养板，加拿大JET公司产品;二甲基亚砜(DMSO)，美国Amerseco公司产品;青霉素、链霉素，美国Hyclone公司产品;甲醇(色谱级、分析纯)、其他试剂均为分析纯，青岛海洋化工厂产品;环磷酰胺，江苏恒瑞制药厂产品。1.3动物昆明种小鼠，雄性18～22g,由哈尔滨医科大学肿瘤医院提供;荷肉瘤S180小鼠，由哈尔滨医科大学肿瘤医院
4、传代培养。1.4肿瘤细胞株人宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肺癌A549细胞和前列腺癌PC-3细胞购于哈尔滨医科大学。2方法2.1紫丁香苷的提取分离称取刺五加干粉3kg，过60目筛，加入甲醇回流提取3次，3h/次，固液比分别为(1∶9，1∶8，1∶8),过滤,合并滤液,回收甲醇,得总浸膏。总浸膏加10倍量水超声振荡使成混悬液,用等量石油醚分别萃取3次,水层再用醋酸乙酯等体积萃取4次,弃去水层,合并醋酸乙酯层,减压浓缩干燥,得浸膏约40g。取35g浸膏,上硅胶柱分离,依次用氯仿-甲醇极性递增梯度洗脱，当氯仿-甲醇为10
5、0∶4时，洗脱得粗结晶紫丁香苷,经甲醇重结晶得紫丁香苷晶体9。2.2紫丁香苷的结构鉴定经UV,EI-MS,NMR光谱以及其他物理化学方法鉴定为紫丁香苷。2.3紫丁香苷的纯度检测取紫丁香苷晶体1mg,加5ml色谱甲醇溶解,经0.45μm微孔滤膜过滤后定容于5ml容量瓶中,即为供试液。色谱条件:色谱柱为ZorbaxExtrendC18,(416mm×250mm,5μm);流动相为乙腈∶水20∶80;流速为1.0ml/min;检测波长为265nm;柱温为室温;进样体积为10μl10。2.4MTT法检测紫丁香苷对4种人癌细胞增殖的体外
6、抑制作用分别取处于指数生长期的A549，PC-3，MCF-7，Hela细胞，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释成20000个细胞/mL，96孔板每孔中加入200μl细胞悬液，置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h，将紫丁香苷用一定浓度的DMSO溶解，每孔中加入设定浓度紫丁香苷，稀释至需要的工作浓度。置于37℃，5%CO2培养箱中培养48h。MTT用PBS配成5mg/ml溶液，每孔中加入20μl，置于37℃，5%CO2孵箱中孵育4h。吸出上清，用PBS洗3次，加入150μlDMSO溶解沉淀物，用振荡器摇匀，酶标仪
7、测定其OD值。计算药物对肿瘤细胞的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组OD/对照组OD)×100%根据实验数据，由OD值计算生长抑制率，将抑制率与药物浓度做图，得出剂量反应曲线，计算出IC50(半数抑制浓度)值。2.5紫丁香苷对小鼠实体瘤S180的抑制作用取生长旺盛的S180腹水瘤小鼠，无菌抽取腹水，用生理盐水(1∶6)稀释，制成细胞悬浮液，取0.1ml于玻璃片上，加0.02%台朌蓝1滴，在光镜下计数，活细胞数应大于95%。取此肿瘤细胞悬液，无菌条件下接种于昆明种小鼠右腋下，每只0.2ml，然后随机分组11。取小鼠8
8、0只，按上述方法造模后，随机分为4组，分别为阳性对照组，紫丁香苷高剂量组、紫丁香苷低剂量组和空白对照组。连续小鼠尾静脉注射给药7d,末次给药后次日处死动物，解剖取瘤，称重，计算抑瘤率，并进行统计学(t检验)处理。计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/模型对照组平均瘤
