免疫组化pv二步法与sp三步法比较论文

《免疫组化pv二步法与sp三步法比较论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、免疫组化PV二步法与SP三步法比较论文黄秀娟张喜邓昊刘丽江镇鸿燕【摘要】目的:用两种不同的免疫组化方法二步法和三步法分别在胃癌组织中进行ERα-36染色结果的比较，寻求不同免疫组化原理的染色试剂盒对实验结果的影响。方法：利用两种不同的试剂盒研究相同的胃癌微阵列芯片（共352点，以肝组织作为定位标志），通过比较两种免疫组化方法在相同组织上表达的不同做比较。结果：三步法制片结果比二步法背景低，阳性率低，非特异性着色小，结果明确易读；而二步法较三步法操作简单，检查阳性率高.freel。ERα-36兔抗人多克隆抗体，由

2、Creighton大学王兆一教授提供，以胞浆着色为阳性。三步法SP超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，二步法PV-9000试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。1.2方法选用已知阳性的正常乳腺组织为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，染色步骤严格按说明书进行。苏木素复染核。以三步法为例，具体操作如下：①石蜡切片常规脱蜡至水化，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3min；②用EDTA缓冲液浸泡(pH8.0),高压修复2min，使抗原暴露；③每张切片加150μl过氧化酶阻断溶液（试剂A），

3、室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3min；④除去PBS液，每张切片加150μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10min；⑤除去血清，每张切片加150μl的第一抗体，4℃过夜；⑥PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS液，每张切片加150μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min；⑦除去PBS液，每张切片加150μl链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液（试剂D），室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min；⑧除去PBS液

4、，每张切片加600μl的新鲜配制的DAB，显微镜下观察3～10min；⑨自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝或冲洗后用PBS快速返蓝；⑩梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。两步法④至⑦步骤与三步法不同，不用正常血清封闭，直接滴加一抗过夜，然后直接滴加聚合了辣根过氧化物酶的特异性二抗，余步骤相同。1.3统计学处理采用卡方检验，所有统计学采用SPSS13.0完成，P＜0.05为差异有显著意义。2结果采用免疫组化三步法对胃癌组织芯片ERα-36进行处理后的染色结果均为浆着色，无核表达。染色结果为癌组织显示棕

5、黄色的颗粒，背景清晰。根据芯片上显色结果的深浅我们对其进行了4个等级的评定：癌细胞胞浆无着色-;癌细胞胞浆上出现淡黄色染色颗粒+;癌细胞的胞浆上出现深棕黄色的染色颗粒为+++；介于+与+++之间染色深度为++。ERα-36的阳性率为(52/111)46.85%，其各个等级表达率见表1。采用免疫组化二步法对胃癌组织芯片ERα-36分别进行处理后，阅片标准同三步法。结果均为浆着色，无核表达。ERα-36的阳性率为(105/111)94.59%，其各个等级表达率见表1。表1二步法与三步法阳性率的比较由表1可见，二步法

6、与三步法各个等级免疫组化ERα-36的阳性率存在显著差异，两步法高于三步法。此外，我们通过使用二步法和三步法对ERα-36进行染色发现，三步法检测结果的背景较二步法低，非特异性着色小，检查出的阳性率低于二步法，且费用相对较少；但二步法步骤少，耗时较少，且无内源性生物素的干扰，检出的阳性率高，染色强度高，见表2。表2二步法与三步法比较3讨论关于胃癌的ER阳性率国外报道为23%（30/130）(免疫组化法)［4］,国内外多项研究发现ERα-36在胃癌中表达。二步法又称非生物素酶法。该方法中的第二抗体是将特异性的抗体

7、和辣根过氧化物酶通过一个多聚糖骨架联接成一个多聚体。PV系列二步法免疫组化检测试剂将二抗抗体分子和酶聚合在氨基酸骨架上，形成多聚体，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，避免再使用生物素。然后通过DAB呈色反应来观察抗原表达部位。三步法又称生物素酶法。我实验室采用SP超敏试剂盒是根据链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（Streptavidin-Peroxidase）链接系统设计的。第二抗体采用生物素标记；链霉菌抗生物素蛋白（SA）是从链霉菌中分离出的蛋白质，分子量为60KD，它含有四个亚基，每个亚

8、基都有与生物素（Biotion）连接的部位，且两者之间有很强的亲和力。SA与过氧化物酶形成SA-过氧化物酶复合体；生物素化的二抗与SA-过氧化物酶复合体，可通过DAB的呈色反应来显示抗原抗体结合部位。我们对芯片的染色结果进行比较和讨论，发现用三步法进行染色的芯片结果明确易读，而二步法阳性率普遍较高，非特异性着色率高。免疫组化三步法染色非特异性着色率比二步法低的原因可能是:①三步法加一抗