流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选ck

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1、流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选ck【摘要】目的比较流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选肝癌亚群细胞的效果。方法原代培养肝细胞癌细胞，分别以流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选ckit+肝癌细胞，然后使用流式细胞仪鉴定细胞纯度，计算回收率；以台盼蓝检测细胞活力，CCK8法检测细胞增殖能力，裸鼠移植测其成瘤率，并进行统计学分析。结果流式细胞仪分选所得到的ckit+肝癌细胞纯度、回收率最高，与其他两种方法分选所得细胞的相应指标比较，差异有统计学意义(P<0.05)；3种方法所得细胞之

2、间的细胞活力、刺激指数、移植成瘤率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪分选前后的细胞之间活力、刺激指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论流式细胞仪分离法是分离肝癌亚群细胞的较佳方法。【关键词】流式细胞仪；免疫磁珠；亲和板结合分离法【Abstract】ObjectiveToparetheeffectofthreemethodsincludingfloetrysorting,magiccellsortingandimmunepanningisolationinisolatingsub

3、-populationinhepatomacarcinomacells.Methodsckitpositivecellsinprimarilyculturedhumanhepatomacarcinomacellsetrysorting,magiccellsortingandimmunepanningisolation,respectively.Thepurity,viabililty,cellproliferationandtheratiooftumorigenesisaftertransplantationo

4、fthehepatomacarcinomacellsinedetry,trypanblueexclusion,CCK8assayandallogeneicgrafttonudemouserespectively.Then,thedataetrysortingethods,ulationindexandtumorigenesisaftertransplantationamongthecellsisolatedethods(P>0.05).Thereetrysorting(P>0.05).Conclusi

5、onsFloetrysortingisaneffectiveandpracticalmethodforisolatingsubpopulationinhepatomacarcinomacells.【Keyetry;Magiccellsorting;Immunepanningisolation肿瘤干细胞研究需要获取高纯度、高活力、高增殖能力的肿瘤亚群细胞，并尽量避免混杂细胞、低活力、低增殖能力细胞对细胞亚群特性的干扰。笔者在前期研究的基础上［1］，比较了流式细胞仪分选(floetrysorting，FCMS)、免疫

6、磁珠分选(magiccellsorting，MACS)及亲和板结合分离法(immunepanningisolation)3种方法分选ckit+肝癌细胞的效果，以期找到一种分离肝癌亚群细胞的较佳方法，为肿瘤干细胞的研究奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1标本：取材于南方医科大学附属珠江医院2006年4月经手术切除的肝癌标本，经病理证实为原发性肝细胞癌。患者术前未进行任何抗肿瘤治疗，手术后患者4周内存活。1.1.2实验动物：裸小鼠(BALB/c)75只，雌雄兼用，3～5周龄，质量10～20g，由南方医科大学动物

7、实验中心提供。1.1.3主要试剂：低糖、胰蛋白酶、无钙镁离子的平衡盐溶液(DHank'S液，pH7.2～7.4)、细胞增殖试剂CCK8购自美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；兔抗人ckit多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG(1∶200)购自丹麦SantaCruz公司；抗兔IgG1免疫磁珠购自德国MiltenyiBiotech公司；其他常用试剂为国产分析纯。1.1.4主要仪器：免疫磁珠分选磁力架、MS磁性分离柱购自德国MiltenyiBiotec公司；EpicsAltra型流式细胞仪购

8、自美国BeckmanCoulter公司；各种常用耗材购自广州威佳科技公司。1.2方法1.2.1分离、培养肝癌细胞：结合分离法，以兔抗人ckit多克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，分选ckit-细胞和ckit+细胞。每种方法分选出5组细胞，进行如下检测。(1)细胞活力检测：采用台盼蓝排斥实验检测细胞活力并计算细胞存活率=［活细胞总数/(活