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1、大脑前动脉穿刺法制作蛛网膜下腔出血大鼠模型【关键词】蛛网膜下腔出血动物模型穿刺蛛网膜下腔出血(Subarachnoidhemorrhage,SAH)是一种常见的出血性脑血管疾病,常继发于动脉瘤破裂出血,居于脑血管意外的第三位,仅次于脑血栓形成及高血压脑出血,其死亡率及致残率较高[1,2]。建立一种简单、稳定、可靠的SAH动物模型来研究SAH后的病理生理变化,对于指导临床治疗具有重要的意义[3]。本研究采用大脑前动脉刺穿法建立大鼠SAH模型,通过测定局部脑血流量(rCBF),微血管直径、密度(MVD),微血管面积比(MVA)验证模型的可靠性,为进一步
2、研究SAH发病与治疗提供简单、可靠的动物模型制作方法。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物SD大鼠雌雄各半,3～4月龄,体重300～350g,由辽宁医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为3组:正常对照组10只,不给予任何处理因素;假手术组10只,仅显微手术分离颈部动脉;模型组10只,显微手术分离颈部动脉,穿刺法制作SAH模型。1.1.2试剂和仪器DBA显色试剂盒(美国SantaCruz公司);立体定位仪(Narishige,Tokyo,Japan),K90牙科台式电钻车(浙江宁波医疗器械厂);激光多普勒血流计(Perimed,瑞典);倒置式生物显
3、微镜(日本奥林巴斯公司),YD-2800型恒温恒冷切片机(上海华岩仪器设备有限公司)。1.2方法1.2.1蛛网膜下腔出血模型的建立10%水合氯醛麻醉大鼠(300mg/kg),立体定向仪固定头部,取颈部正中切口切开皮肤,在显微镜下暴露左侧颈总动脉(CCA)主干及分叉处,显露左侧颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA),分离颈外动脉近分叉处分支,包括甲状腺上动脉和咽升动脉等,用双极电凝器电凝离断,电凝翼腭动脉,于ECA远心端结扎并剪断,拉直ECA使其与ICA成一直线。将3-0单丝尼龙线(长约5cm,前端用手术刀片切成斜面)经ECA导入ICA,用显微手术镊
4、将进入颈内动脉的尼龙线继续插入,当进至翼腭动脉超始部时,轻抬颈外动脉使此处的弯曲消失,以利尼龙线顺利通过。向远端继续插入尼龙线至颈内动脉颅内段,有阻力感后再插入2mm左右刺破m处电钻钻1个直径约3mm的平底小孔,用另一立体定向仪的微操纵臂将激光多普勒血流计(LDF),LDF探头垂直置放于硬脑膜上,LDF探头与LDF血流仪相连,通过微机屏幕连续记录前后前脑局部脑血流量(rCBF)。LDF探头经固定得到合适的rCBF信号,在整个实验过程中保持探头的位置和深度不变。1.2.3脑微血管染色和微血管定量分析造模后3d快速断头处死大鼠,取额区(regionfr
5、ontalis)脑组织,10%中性甲醛液固定12h后,蔗糖梯度脱水,连续冰冻切片,片厚50μm,用涂有铬矾明胶的载玻片贴片。每只大鼠取6张切片,采用DAB法染色后常规晾干、脱水、固定、封片。每张切片在倒置显微镜200倍下拍照额区微血管5个视野,用Image-proplus图像分析软件分析每个视野下的微血管直径、微血管个数和微血管面积,并以单位面积内的微血管数目和面积作为MVD、MVA。每只大鼠取6张切片计算平均值。1.2.4统计学处理数据以均值±标准差（±s）表示,应用SPSS12.0软件系统分析,应用方差分析及q检验进行统计学处理。2.2局部脑血
6、流量变化正常对照组和假手术组在穿刺后rCBF无明显变化。造模组在穿刺后rCBF即显著下降,穿刺后10min时达术前值的45.12%,在穿刺后20min时达术前的35.74%,随后rCBF呈缓慢回升的趋势,整个观察时间内维持在低水平,至穿刺结束后2h,为术前值的44.53%,各时点的均显著低于假手术组和对照组(P<0.05,图1)。图1各组大鼠局部脑血流量改变2.3SAH后脑微血管的变化造模后3d对各组大鼠行颅脑解剖,模型组大鼠DAB染色后额区脑血管呈棕黑色,额区MVD、MVA与正常组对照组及假手术组相比均显著下降(表1)。表1额区微血管染色图
7、像分析注：*与正常组及假手术比较P<0.05 3讨论目前制造蛛网膜下腔出血模型一般采用两种方式[4]:一是将自体动脉血直接注入蛛网膜下腔;二是刺破颈内动脉颅内段某一部位,使血液自动流入蛛网膜下腔。第一种方式操作复杂不易掌握,且需要开颅,容易对动物的大脑造成损伤[5]。本研究采用大脑前动脉血管穿刺法建立的大鼠模型,避免了以往穿刺法制作模型需要暂时阻断颈总动脉,可能引起短暂局部脑缺血的不足。主要有以下几方面优点:（1）手术简单、可靠,操作主要在颈部,非开颅方法,手术创伤小;（2）出血时有动脉壁的损伤及血管内膜与脑组织的接触,考虑了血管内膜分泌的
8、血管活性物质对脑组织的损害作用;（3）模拟了动脉瘤破裂时血流对脑组织的直接冲击作用;（4）临床上前循环动脉瘤发生率较高,经
