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1、大脑前动脉穿刺法制作蛛网膜下腔出血大鼠模型【摘要】目的应用穿刺法制作蛛网膜下腔出血(SAH)动物模型,为SAH的实验研究提供简单、可靠的模型制作方法。方法以SD大鼠为实验动物,将动物分为正常对照组、假手术组和模型组。显微手术分离大鼠左颈部动脉,使用锐化尼龙线经颈外动脉进入颈内动脉至颅内,穿刺大脑前动脉形成SAH。假手术组仅分离颈部动脉不实施穿刺。测定各组2h内局部脑血流量(rCBF),3d后用DAB染色法显示大鼠额区微血管,测定微血管直径、密度(MVD)、微血管面积比(MVA)。结果模型组大鼠颅脑解剖发现蛛网膜下腔内大量的血液和血凝块,术后2h内rCBF显著
2、降低,3d后模型组大鼠额区微血管直径、MVD、MVA明显下降。结论应用大脑前动穿刺法成功建立了简单、可靠、接近于临床的大鼠SAH模型。【关键词】蛛网膜下腔出血动物模型穿刺蛛网膜下腔出血(Subarachnoid8hemorrhage,SAH)是一种常见的出血性脑血管疾病,常继发于动脉瘤破裂出血,居于脑血管意外的第三位,仅次于脑血栓形成及高血压脑出血,其死亡率及致残率较高[1,2]。建立一种简单、稳定、可靠的SAH动物模型来研究SAH后的病理生理变化,对于指导临床治疗具有重要的意义[3]。本研究采用大脑前动脉刺穿法建立大鼠SAH模型,通过测定局部脑血流量(rC
3、BF),微血管直径、密度(MVD),微血管面积比(MVA)验证模型的可靠性,为进一步研究SAH发病与治疗提供简单、可靠的动物模型制作方法。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物SD大鼠雌雄各半,3～4月龄,体重300～350g,由辽宁医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为3组:正常对照组10只,不给予任何处理因素;假手术组10只,仅显微手术分离颈部动脉;模型组10只,显微手术分离颈部动脉,穿刺法制作SAH模型。1.1.2试剂和仪器DBA显色试剂盒(美国SantaCruz公司);立体定位仪(Narishige,Tokyo,Japan),K90牙科台式电钻车(浙
4、江宁波医疗器械厂);激光多普勒血流计(Perimed,瑞典);倒置式生物显微镜(日本奥林巴斯公司),YD-2800型恒温恒冷切片机(上海华岩仪器设备有限公司)。1.2方法81.2.1蛛网膜下腔出血模型的建立10%水合氯醛麻醉大鼠(300mg/kg),立体定向仪固定头部,取颈部正中切口切开皮肤,在显微镜下暴露左侧颈总动脉(CCA)主干及分叉处,显露左侧颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA),分离颈外动脉近分叉处分支,包括甲状腺上动脉和咽升动脉等,用双极电凝器电凝离断,电凝翼腭动脉,于ECA远心端结扎并剪断,拉直ECA使其与ICA成一直线。将3-0单丝尼龙线(长
5、约5cm,前端用手术刀片切成斜面)经ECA导入ICA,用显微手术镊将进入颈内动脉的尼龙线继续插入,当进至翼腭动脉超始部时,轻抬颈外动脉使此处的弯曲消失,以利尼龙线顺利通过。向远端继续插入尼龙线至颈内动脉颅内段,有阻力感后再插入2mm左右刺破willis环,造成蛛网膜下腔出血,迅速将尼龙线拔出,整个过程不超过30s。假手术组除不刺破血管外,其余操作与前两组相同。1.2.2局部脑血流量检测穿刺手术前大鼠俯卧固定,取颅顶正中切口,于冠状缝旁5mm处电钻钻1个直径约3mm的平底小孔,8用另一立体定向仪的微操纵臂将激光多普勒血流计(LDF),LDF探头垂直置放于硬脑膜
6、上,LDF探头与LDF血流仪相连,通过微机屏幕连续记录前后前脑局部脑血流量(rCBF)。LDF探头经固定得到合适的rCBF信号,在整个实验过程中保持探头的位置和深度不变。1.2.3脑微血管染色和微血管定量分析造模后3d快速断头处死大鼠,取额区(regionfrontalis)脑组织,10%中性甲醛液固定12h后,蔗糖梯度脱水,连续冰冻切片,片厚50μm,用涂有铬矾明胶的载玻片贴片。每只大鼠取6张切片,采用DAB法染色后常规晾干、脱水、固定、封片。每张切片在倒置显微镜200倍下拍照额区微血管5个视野,用Image-proplus图像分析软件分析每个视野下的微血
7、管直径、微血管个数和微血管面积,并以单位面积内的微血管数目和面积作为MVD、MVA。每只大鼠取6张切片计算平均值。1.2.4统计学处理数据以均值±标准差（±s）表示,应用SPSS12.0软件系统分析,应用方差分析及q检验进行统计学处理。2结果2.1模型验证造模38d后处死各组大鼠行颅脑解剖观察,见造模组大鼠蛛网膜下腔中有弥漫分布的血液及血凝块,主要分布于前颅窝、蝶鞍处及后颅窝,覆盖脑底部的主要血管,对照组和假手术组未发现SAH现象,所有动物均未发现脑实质的出血或机械损伤。2.2局部脑血流量变化正常对照组和假手术组在穿刺后rCBF无明显变化。造模组在穿刺后rC
8、BF即显著下降,穿刺后10min时达术前值的45.1
