实验六叶绿素的提取分离

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1、叶绿素的提取、分离一、实验目的1.掌握从植物叶中提取叶绿素的方法。2.了解纸层层析的原理，掌握纸层析的一般操作和定性鉴定方法。二、实验原理1.叶绿素提取原理：叶绿素等是脂溶性的有机分子，根裾相似相溶的原理，叶绿体屮含有叶绿体色素（叶绿素a和b、胡萝卜素及叶黄素）等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂提取而不用水。2.色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用浞合物屮各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤

2、纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样屮各组份便随着流动相溶剂肉前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样屮各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。毛细管点样薄层色谱展开三、仪器和药品研钵、毛细管、漏斗、纱布、小烧杯、试管、培养皿等95%酒精、丙酮、石油醚碳酸钙

3、，石英砂四、实验步骤（1）収菠菜或其他植物新鲜叶八20g左右，洗净，用滤纸擦干，去掉叶柄和巾脉剪碎，放入研钵。（2）研钵中加入少量碳酸钙和石英砂，加4-5ml无水乙醇，研磨至糊状，再加10ml无水乙醇充分混匀以提取叶片匀浆中的色素，15-20分钟后，过滤入50ml锥形瓶巾加塞待用。分离：（1）取圆形定性滤纸一张（直径15cm）,将其剪成滤纸条（15cmx2cm）,将其2cm—端剪去两侧，中间留一长约1.5cm,宽约0.5cm的窄条，并在滤纸剪LI上方用铅笔画一条直线，作为画滤液细线的基准线（注意：滤液线必须距底边l-1.5cm）。

4、用毛细管吸取乙醇叶绿体色素提取液，沿纸条的滤液线涂，等风干后，再重复操作数2-3次。（用滤液涂圆点状类似）（2）在层析缸巾加入适量（约2ml）的丙酮作为推动剂，将滤纸条带有色素的一端轻轻插入层析缸巾，使滤纸条下端浸入推动剂中。迅速盖好层析缸盖，静置40-60inin。此时，推动剂借毛细管引力顺滤纸条向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的条带。（3）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素，从上到下为：胡萝卜素为橙黄色、叶黄素为鲜黄色、叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，用铅笔标出各种色素

5、的位置和名称。五、数据记录六、注意事项：1.纸层析法中所用的有机溶剂如丙酮、石油醚等，一般有挥发性、并有一定毒性，使用时要注意密封层析，避免吸入过多有害挥发物。2.叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片成，使色素溶解于酒精中。3.插入层析液的滤纸条一端剪去两个角，由于液面的不同位置表面张力不同，纸条接近液而时，其边缘的表而的张力较大，层析液沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。4.加入的层析液要适量，滤纸放入层析缸时色素滤液线不能接入层析液，为了防止滤纸条倒入层析液中而

6、使层析实验失败。同时，防止因液体表而张力引起层析液沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。七、思考题：1.在研磨时为什么加入适量的碳酸钙粉末？2.在过滤时为什么选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸？3.画滤纸细线前滤纸必须经过风干处理，为什么不用火烤干或在烘箱内烘干？