生化大实验步骤

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1、（1）碱裂解法大量提取质粒DNA分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。（2）目的基因的PCR扩增加入常规PCR反应体系，经变性、复性、延伸等多次循环。电泳检测：用DNAmarker来判断扩增片段的大小，从PH性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的效率；明性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。（3）目的基因、质粒的酶切与连接PCR产物双酶切（Xhol、EcoRI）,pPI9K质粒双酶切（Xhor部分酶切、EcoRI完全酶切）PCR产物双

2、酶切可用乙醇沉淀回收；质粒回收，电泳回收，酶切后9K大小的线性八段川于连接回收产物电泳检测后进行连接：T4Ligase（4）大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12法）将转化大肠杆歯感受态细胞，按每200U丨菌液加lOOng已纯化的质粒DNA（无菌操作）的标准，将5-10P1DNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30min。（同吋作两个对照组即受体菌对照组（-）和质粒DNA对照组（+），检测感受态细胞的质量及有无污染情况）用烧烤过的涂布将100ul的菌液涂布于加相应抗生素（Amp+50ppm）的LB固体培养基，涂

3、匀，罝于超净台上1小时左右至菌液完全被培养基吸收。37°C倒置培养12-24小吋。从平板上挑选抗性菌落进行鉴定。（5）菌落PCR筛选阳性重组子及重组质粒的酶切鉴定30个克隆另加一个阳性对照抽取每种扩增产物5-10ul，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAmarker来判断扩增片段的大小。（6）质粒酶切及电转化毕赤酵母（7）线性化质粒的制备Sacl酶切质粒3小时，电泳检测酶切结果，回收质粒（8）酵母感受态细胞的制备保种菌接种于3mlYPD培养基中30°C揺菌过夜，收集菌体制备感受态细胞（9）用电转仪进行电转化（10）阳性

4、克隆筛选电转成功后，将菌液涂于RDB板上，30°C恒温培养箱培养2-3天，观察克隆生长状况。长出克隆后挑选单菌落作PCR，鉴定其是否为阳性克隆。若获得阳性克隆则揺菌保种，划线鉴定，小量表达，电泳检测目的基因。（11）重组蛋白的表达及westernblot鉴定挑酵母重组子接种于3mlYPD，摇菌过夜，转接于400mlBMGY培养基摇培，加甲醇，24h后再添加lml甲醇，24h后收菌，离心，留上清。（12）westernblot鉴定：制备聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳分离H的蛋白，将其转移到醋酸纤维膜上，封闭：将膜用TBS从下向上

5、浸湿后，移至含有封闭液的培养皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。用TBS将膜上的封闭液洗去（轻轻晃晃就可）孵育一抗，孵育二抗，DAB显色，DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物（15）重组蛋白的纯化上步所得上清，进行65%硫酸铵沉淀，离心，2mlTris缓冲液溶解，将溶解的液体放入透析袋，透析约16h，每隔6h换-次透析液，透析完毕后过离子交换层析柱（Q柱）。2、自己找答案表达系统的选择：毕赤酵母蛋白产物糖基化简单，产物直接以川'溶性，天然性形式分泌到胞外。3、分离纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白

6、质之间的各种特性的差异，包括分子的大小和形状、电荷、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力。根据分子大小不同的纯化方法包括透析和超过滤、密度悌度离心、凝胶过滤，透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。超过滤则是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋0质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。密度梯度离心则是利用蛋白质颗粒的沉降性质，蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质屮离心时，质呈和密度大的颗粒比质呈和密度小的颗粒沉降的快，当每种蛋白质达沉降到与自身密度

7、相等的介质密度梯度吋便会停止不前，最后各种蛋白在离心管中分离成各自独立的区带,分部收集即可。凝胶过滤的原理是当不同分子大小的蛋白质经凝胶沉层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之间缝隙向T移动并最先流出柱外，因此大分子物质先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。利用溶解度差别的纯化方法包括等电点沉淀和pH控制、蛋白质的盐析和盐溶、有机溶剂分级分离法、温度对蛋白质溶解度的影响等。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质等电点吋溶解度最低原理可以将蛋白质和混合物分离开；一般中性盐对球状蛋白的溶解度有显

8、著影响，低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐洛，当离子强度增加足够高时，很多蛋白可以从溶液中沉淀出来,称为盐析;有机溶剂可以通过改变介质的介电常数来使不同蛋白质沉淀,从而达到分离效果。根据电荷不同的纯化方法有电泳和离子交换层析等，电泳是在外电场的作用下，不同带电颗粒的蛋白质将向与其相反的电极移动，常用的有I