cck8对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关蛋白质的实验分析

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1、CCK8对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关蛋白质的实验分析刘晓燕李洪李娟王丽段承刚陶忠桦何涛【摘要】目的探讨八肽胆囊收缩素（CCK8）对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的保护作用。方法检测CCK8对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠模型的刺激前后血糖和血清胰岛素的水平，采用双向电泳并结合生物信息学方法，观察刺激前后胰腺组织蛋白质表达的差异。结果初步确定了CCK8刺激引起胰岛细胞JIP1、RBBP7、PP2AB、PDX1、BCLX5种蛋白质的表达明显增强，这些蛋白在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、刺激胰岛素基

2、因表达等方面发挥重要作用。结论CCK8可能通过刺激特异蛋白质的表达，对糖尿病大鼠受损胰岛细胞起到一定的保护和恢复作用。【关键词】CCK8；糖尿病模型；胰岛细胞；蛋白质表达；大鼠胆囊收缩素（CCK）是广泛分布于胃肠道及中枢和周围神经系统一种典型的脑肠肽，具有生物学功能的多样性，CCK8是具有CCK完全功能的最小活性片段，在种属间具有相对保守性。研究发现CCK有明显的刺激胰岛素分泌的作用，也是调节胰腺细胞再生的主要胃肠激素〔1，2〕。近来的有关CCK8治疗2型糖尿病的研究显示，CCK及其类似物

3、是极具潜力的2型糖尿病的治疗药物〔3～5〕。但目前有关CCK对于糖尿病胰岛细胞损伤是否具有保护作用及其机制还知之甚少。本研究在建立糖尿病大鼠模型的基础上，采用双向电泳等技术观察CCK8是否通过刺激特异性蛋白质的表达，进一步深化对CCK8胰腺保护作用的认识，拓展CCK及其类似物在2型糖尿病治疗中的应用提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1动物及主要试剂　　SD大鼠（重庆腾鑫生物技术有限公司）；CCK8和链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、超纯尿

4、素、二硫苏糖醇、CHAPS、甘氨酸、甲基乙二胺(TEMED)、磷酸三丁酯(TBP)、过硫酸铵（APS）、十二烷基磺酸钠（SDS）、固相pH梯度干胶条（pH3～10，17cm）和矿物油均购自BioRad公司；枸橼酸钠购自中国上海试剂一厂；蛋白分子量Marker和苯甲基磺酰氟（PMSF）购自碧云天生物技术研究所；125I胰岛素放射免疫试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司。　　1.2实验方法　　1.2.1分组及糖尿病模型的建造　　SD大鼠68只，随机分为正常对照组和糖尿病模型组。糖尿病模型组大鼠禁

5、食10h，按55mg/kg腹腔内注射STZ溶液（用0.1%无菌枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成2%溶液，调pH=4.5，过滤除菌）。　　1.2.2CCK8的注射　　随机取对照组和糖尿病模型组大鼠各30只，腹腔内分别注射生理盐水0.1ml或10-6mol/LCCK80.1ml，于1、2及3d后各时间点处死大鼠10只，取血清及胰腺组织-80℃冻存待用。　　1.2.3血清胰岛素及血糖的测定　　各组血清胰岛素浓度采用125I放射免疫法进行检测。各组SD大鼠于造模前后和给药前后采用血糖仪（德国罗氏诊断公司）检

6、测尾静脉血血糖浓度。　　1.2.4蛋白样品的制备　　取50mg胰腺组织加入300μl裂解液（8mol/L尿素+0.2%Biolyte+0.1%CHAPS+15μlPMSF），剪刀剪碎并用小圆头玻棒研磨，冰上裂解30min，12000r/mim离心60min。取上清液用Bradford法测蛋白浓度，分装，-80℃冻存。　　1.2.5蛋白质组双向电泳分离　　分别取各组蛋白样品800mg，加水化液（裂解液+DTT0.01g/L+Biolyte5μl/ml+0.1%溴酚蓝10μl）至总量300μl/胶

7、条，混匀后加入水化槽，将胶条放置1h后加入矿物油覆盖过夜。将水化后的胶条转移至等电聚焦电泳系统(BioRad)，于17℃进行聚焦，程序设置为250V，30min→1000V，1h→10000V，5h→10000V，6h→250V，2h，总伏时数约为8万伏时。取出胶条，加入平衡液（6mol/L尿素+2％SDS+20％甘油+0.375mol/LTrisHCl，pH=8.8）+20%DTT，平衡15min；再将胶条小心放于10%分离胶顶端，用0.5%的琼脂糖（含少量溴酚蓝）封闭胶条进行第二向SDS

8、PAGE电泳，电泳参数为10mA/胶条，1h；以后为20mA/胶条。待溴酚蓝接近分离胶底端时停止电泳。　　1.2.6考马斯亮蓝染色按常规方法进行。　　1.2.7凝胶成像及双向电泳图谱分析　　将染色后的凝胶置ChemiDocXRS凝胶成像系统(BioRad)中照相成像。采用ImageMaster2DPlatinum(Amersham)双向电泳图谱分析软件进行斑点自动识别、定量检测及匹配对比分析。获得各蛋白斑点的实验等电点（pI）和分子量（MW），结合组织表达特异性，采用TagIde