地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞tea

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1、地鳖虫活性蛋白对人舌癌细胞Tea【摘要】目的研究地鳖虫蛋白对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制作用，探索地鳖虫蛋白质的抗肿瘤活性。方法采用MTT法测定地鳖虫蛋白质对人舌癌细胞Tea-8113增殖的抑制效果。结果地鳖虫蛋白质在体外能显著抑制人舌癌细胞Tea-8113的增殖，药物浓度0.0902g·ml-1，药物作用72h抑制率最高，达到92.96％，并呈现明显的药物剂量依赖关系。结论地鳖虫蛋白质有较强的体外抗肿瘤活性。【关键词】地鳖虫活性蛋白Tea-8113细胞MTT法抗肿瘤活性Abstract：ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffecto

2、fprotEinofEupolyphagaonhumantonguecancercelllineTea-8113.MethodsTheMTTassayinetheproliferationinhibitoryactivity.ResultsTheprotEInofEupolyphagahadobviousanti-proliferationactivityonTea-8113invitroinconcentrationandtimedependentmanners,theinhibitionrateland72hours.ConclusionTheproteinofEupolyp

3、hagahasanobviousinhibitoryeffectontheproliferationofTea-8113invitro.Keyicactivity地鳖虫EupolyphagasinensisI1640培养基，37℃，5％CO2培养箱中，完全饱和湿度条件下培养，3～4d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。1.2药物及试剂地鳖虫成虫（雌性）购自广州市花鸟市场，由广东工业大学生药研究室鉴定。RPMI1640培养液、小牛血清均为美国GIBCO公司产品，MTT（噻唑兰）、二甲基亚砜、胰蛋白酶均为美国AMRESCO公司产品，超纯水自制，其余试剂均用国产分析纯。常规培养。1.3

4、仪器CO2培养箱为美国SHELLAB公司产品，倒置显微镜购自重庆奥特光学公司，超净工作台为苏净集团产品，680型酶标仪购自美国BIO-RAD公司。2方法2.1地鳖虫活性蛋白质（EES）的制备取200g新鲜地鳖虫剪碎，加入200ml预冷的0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4),匀浆，再加300ml上述缓冲液，4℃浸提过夜，4000r/min离心20min，弃沉淀，上清用sevag法提取蛋白质，收集40%～65%饱和度盐析组分［4］，透析除盐，层析分离并收集蛋白质组分，洗脱液为含1.0mol/LNaCl的0.02mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液梯度洗脱,恒流泵流速为4

5、0，10min收集1管。分别收集各蛋白峰液体，真空冷冻将蛋白质制成粉末备用。2.2SDS-PAGE电泳［5］采用SDS-PAGE法分析制备蛋白质组成。浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12％，考马斯亮蓝G－250染色，甲醇/冰乙酸脱色。由低标准蛋白质绘制标准曲线，测定测试样品的迁移距离，计算相对迁移率(mR)，由标准曲线求得测试样品的分子量。2.3地鳖虫活性蛋白对人舌癌Tea-8113细胞的体外抑制作用（MTT法）［6］用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的Tea-8113细胞，将5.0×104／ml细胞悬液接种于96孔培养板中,每孔100μl，培养15h细胞贴壁后，分别加入PBS(阴性对照

6、)以及终质量浓度（0.0101，0.0302，0.0501，0.0702和0.0902g/ml）的EES各20μl，每组均设4个复孔。置饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养24，48，72h,结束前4～6h各培养孔分别加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h，弃培养上清液,每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200μl溶解液，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(A)值,测定波长为490nm,用不含细胞培养液而同样作其他处理组作本底,校正测量值,取4孔A值平均数,按以下公式计算抑制舌癌细胞的生长抑制率。细胞增殖抑制率（％）=［1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)

7、］×100％2.4统计学处理统计学分析采用SPSS10.0软件，结果以±s表示。实验均重复3次。3结果3.1地鳖虫活性蛋白质（EES）的分离纯化地鳖虫经匀浆、盐析、透析得到EES粗提物，将该粗提物上DEAE-32纤维素离子交换柱层析，介质经预处理后装柱，柱预先用0．05mol／L，pH7．8的PBS平衡，上柱后用含1.0mol/LNaCl的0.02mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液梯度洗脱至在280nm波长无光吸收。洗脱液出现3个蛋白峰（见图1），分别收集各峰蛋白质，经检