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时间:2018-11-11
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1、抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF作者:骆群,吕明,于鸣,黎燕【摘要】为了探讨体外激活T淋巴细胞的方法及活化后T淋巴细胞的免疫学特征,利用抗CD3、抗CD28抗体在体外刺激健康人外周血单个核细胞PBMNC,检测淋巴细胞转化,CD8+CD25+细胞比例和肿瘤生长因子β(TGF-β)表达等相关免疫学指标。结果表明,在抗CD28抗体的协同作用下,抗CD3抗体的刺激活性明显提高,CD8+CD25+细胞比例明显增加,TGF-β的表达下调。结论:抗CD28抗体协同刺激可以提供第二信号,使T淋巴细胞充分活化,TGF-β表达水平明显下降【关键词】抗C
2、D3抗体 Anti-CD28AntibodyCostimulationEnhancesAnti-CD3antibodActivatingTCellsandLomunologicalcharacteristics,theanti-CD3andanti-CD28McAbsulatePBMNC,thenthEIrrelatedimmunologicalchanges,suchaslymphocytetransformationfunction,thepercentageofCD8+CD25+cellsandTGF-βexpressionplocytetransformat
3、ionassay,floetryandRT-PCRrespectively.Theresultsshoulationulathetion,theactivityofanti-CD3antibodyulationcouldprovidestimulatorysignalⅡ,akeTcellsmoreactive,ershamBioxciences公司。抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体由军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室提供。FITC标记的抗CD8、PE标记的抗CD25抗体购自BectonDickinson公司。3H-TdR购自中国原子能研究所。RPMI164
4、0培养液购自Gibco公司。TGF-βELISA检测试剂盒购自BectonDickinson公司,TrizoL购自Invitrigen公司。 方法 PBMNC分离 取正常人外周血,用肝素钠抗凝,生理盐水2倍稀释后小心加入等体积的淋巴细胞分离液(ρ=1.077g/mL),2500×g离心20分钟,取中间单个核细胞层,生理盐水洗2遍,用含10%FCS的RPMI1640培养液制备成浓度为1×106/ml的单个核细胞悬液备用。 淋巴细胞转化试验 分离人外周血单个核细胞(PBMNC),调整细胞密度为1×109/L,加入96孔板,100μl/l)、CD28抗体(5μg/
5、ml),设三个复孔,并设PBS阴性对照孔,于5%CO2、37℃培养56小时。加3H-TdR(1mCi/ml)0.5μCi/值。计算刺激指数(SI)=(实验组cpm值-本底值)/(阴性对照组cpm值-本底值)。 细胞亚群的FACS分析 收集PBMNC,用含2%FCS、0.2g/L叠氮钠的10mmol/LPBS洗3次;加入相应抗体,以PBS为阴性对照,冰浴振荡30分钟;3400×g离心30秒,收集细胞,将细胞洗3遍后用10g/L的多聚甲醛固定。用FACSCalibur流式细胞仪检测分析。 RNA的提取 收集PBMNC,PBS洗涤记数。按1×106/ml浓度细胞加入
6、TrizoL,剧烈震荡裂解细胞。室温静置5分钟后,每1mlTrizoL加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15秒,室温静置10分钟。将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机,4℃,13400×g离心15分钟。小心吸取上层液相置于另一无菌Eppendorf管中,加入等体积异丙醇,室温沉淀10分钟。4℃,13400×g离心10分钟,弃上清,沉淀用75%乙醇洗涤1遍,沉淀的RNA在室温自然干燥。用30μl无RNA酶的DEPC水重悬干燥后的RNA。电泳分析以及分光光度计定量,用于下一步实验或-70℃长期保存。 cDNA逆转录 取约含1μg稀释的RNA溶液,加入Oligo(dT
7、)1μl,70℃孵育5分钟,迅速放入冰中冷却,依次按说明书加入2.5mmol/LdNTP、5×反转录缓冲液、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂,DEPC水。将上述反应物混匀后,42℃反应60分钟,95℃5分钟灭活反转录酶,获得的cDNA置-20℃保存备用。 TGF-β表达水平的半定量PCR测定 利用Biosun核酸分析软件,分析TGF-β基因的全序列,获得特异性的区间,设计特异性的引物。取等量的各组cDNA为模板,以GAPDH做为内参照,用半定量的方法测定TGF-β的表达水平。PCR条件如下:94℃预变性5分钟后;开始下列循环:94℃变性30秒,55
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