抗cd28抗体协同刺激增强抗cd3抗体体外激活t淋巴细胞并降低tgf

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1、抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF作者：骆群，吕明，于鸣，黎燕【摘要】为了探讨体外激活T淋巴细胞的方法及活化后T淋巴细胞的免疫学特征，利用抗CD3、抗CD28抗体在体外刺激健康人外周血单个核细胞PBMNC，检测淋巴细胞转化，CD8+CD25+细胞比例和肿瘤生长因子β（TGF-β）表达等相关免疫学指标。结果表明，在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的刺激活性明显提高，CD8+CD25+细胞比例明显增加，TGF-β的表达下调。结论：抗CD28抗体协同刺激可以提供第二信号，使T淋巴细胞充分活化，TGF-β表达水平明显下降【关键词】抗C

2、D3抗体　　Anti-CD28AntibodyCostimulationEnhancesAnti-CD3antibodActivatingTCellsandLomunologicalcharacteristics，theanti-CD3andanti-CD28McAbsulatePBMNC，thenthEIrrelatedimmunologicalchanges，suchaslymphocytetransformationfunction，thepercentageofCD8+CD25+cellsandTGF-βexpressionplocytetransformat

3、ionassay，floetryandRT-PCRrespectively.Theresultsshoulationulathetion，theactivityofanti-CD3antibodyulationcouldprovidestimulatorysignalⅡ，akeTcellsmoreactive，ershamBioxciences公司。抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体由军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室提供。FITC标记的抗CD8、PE标记的抗CD25抗体购自BectonDickinson公司。3H-TdR购自中国原子能研究所。RPMI164

4、0培养液购自Gibco公司。TGF-βELISA检测试剂盒购自BectonDickinson公司，TrizoL购自Invitrigen公司。　　方法　　PBMNC分离　　取正常人外周血，用肝素钠抗凝，生理盐水2倍稀释后小心加入等体积的淋巴细胞分离液（ρ=1.077g/mL），2500×g离心20分钟，取中间单个核细胞层，生理盐水洗2遍，用含10%FCS的RPMI1640培养液制备成浓度为1×106/ml的单个核细胞悬液备用。　　淋巴细胞转化试验　　分离人外周血单个核细胞（PBMNC），调整细胞密度为1×109/L，加入96孔板，100μl/l）、CD28抗体（5μg/

5、ml），设三个复孔，并设PBS阴性对照孔，于5%CO2、37℃培养56小时。加3H-TdR（1mCi/ml）0.5μCi/值。计算刺激指数（SI）=（实验组cpm值-本底值）/（阴性对照组cpm值-本底值）。　　细胞亚群的FACS分析　　收集PBMNC，用含2%FCS、0.2g/L叠氮钠的10mmol/LPBS洗3次；加入相应抗体，以PBS为阴性对照，冰浴振荡30分钟；3400×g离心30秒，收集细胞，将细胞洗3遍后用10g/L的多聚甲醛固定。用FACSCalibur流式细胞仪检测分析。　　RNA的提取　　收集PBMNC，PBS洗涤记数。按1×106/ml浓度细胞加入

6、TrizoL，剧烈震荡裂解细胞。室温静置5分钟后，每1mlTrizoL加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置10分钟。将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，4℃，13400×g离心15分钟。小心吸取上层液相置于另一无菌Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，室温沉淀10分钟。4℃，13400×g离心10分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤1遍，沉淀的RNA在室温自然干燥。用30μl无RNA酶的DEPC水重悬干燥后的RNA。电泳分析以及分光光度计定量，用于下一步实验或-70℃长期保存。　　cDNA逆转录　　取约含1μg稀释的RNA溶液，加入Oligo(dT

7、)1μl，70℃孵育5分钟，迅速放入冰中冷却，依次按说明书加入2.5mmol/LdNTP、5×反转录缓冲液、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂，DEPC水。将上述反应物混匀后，42℃反应60分钟，95℃5分钟灭活反转录酶，获得的cDNA置-20℃保存备用。　　TGF-β表达水平的半定量PCR测定　　利用Biosun核酸分析软件，分析TGF-β基因的全序列，获得特异性的区间，设计特异性的引物。取等量的各组cDNA为模板，以GAPDH做为内参照，用半定量的方法测定TGF-β的表达水平。PCR条件如下：94℃预变性5分钟后；开始下列循环：94℃变性30秒，55