hmgb1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和ia-e表达

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1、HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和IA/E表达【摘要】目的:探讨HMGB1对巨噬细胞免疫功能的影响。方法:梯度浓度HMGB1处理小鼠腹腔巨噬细胞,或将小鼠随机分为生理盐水对照、24h和48h高与低剂量HMGB1注射组,腹腔注射0.2μg或20μgHMGB1,或生理盐水。检测巨噬细胞吞噬功能和IA/E表达。结果:10μg/LHMGB1刺激6～12h,巨噬细胞吞噬功能较其他剂量组明显增强(P<0.05或P<0.01)。HMGB1对培养巨噬细胞IA/E表达无影响。高剂量HMGB1攻击小鼠24h,其

2、腹腔巨噬细胞吞噬能力明显降低（P<0.05）;低剂量HMGB1攻击48h,巨噬细胞IA/E表达明显上调（P<0.05或P<0.01）。结论:高剂量HMGB1抑制巨噬细胞吞噬功能,低剂量HMGB1增强巨噬细胞免疫功能。【关键词】高迁移率族蛋白B1巨噬细胞吞噬IA抗原IE抗原　　新近研究发现,核内蛋白高迁移率族蛋白B1（highmobilitygroupbox1protein,HMGB1）可由死亡细胞或活化单核/巨噬细胞释放至胞外,发挥广泛促炎效应［1,2］。因较TNFα、IL1β等

3、分泌延迟、持续时间久,国内外学者将HMGB1称作“晚期”炎症介质［1,3］。若拮抗HMGB1,则脓毒症动物脏器功能改善,生存率增加［4］。HMGB1能否影响单核/巨噬细胞其他功能,如免疫防御、免疫监视、抗原提呈及免疫调节等,其影响的程度及范围如何？这些问题尚待阐明。鉴于此,我们将探讨HMGB1对体内外巨噬细胞吞噬和抗原提呈功能影响,为脓毒症HMGB1拮抗治疗方案提供免疫学证据。　　1材料和方法　　1.1材料DMEM(Hyclone)、胎牛血清(特优级,Hyclone)、多黏菌素B(Sigma)、HMGB1(Si

4、gma)、0.72g/L中性红溶液、Hanks液、细胞消化液(无钙镁Hanks液+2.5g/L胰酶+0.2g/LEDTA)、细胞裂解液(冰醋酸与无水乙醇1∶1混合)。RPE标记抗IA/E及RPE标记同型对照、FITC标记抗CD14、抗FcγⅡ/Ⅲ受体抗体、染色缓冲液,购自BD/PharMingen公司。流式细胞分析仪（FACS/Calibur）为BectonDickinson产品。　　1.2方法　　1.2.1腹腔巨噬细胞的分离、纯化常规方法,用DMEM(100mL/LFCS)调整腹腔巨噬细胞密度为3×

5、109/L,备用。　　1.2.2体外试验分组3×109/L巨噬细胞入96孔培养板,0.1mL/孔,孵育2h,去未贴壁细胞,加DMEM(100mL/LFCS)0.1mL/孔,多黏菌素B(7×106U/L)1μL/孔,以中和可能沾染内毒素。台盼蓝染色证实细胞活率>95%,瑞氏染色证实巨噬细胞纯度>85%。再分为培养体系内HMGB1终浓度为0、1、10、100、1000、5000μg/L6个组,每浓度3个平行孔,分为0、3、6、12、24h时相,分别在培养终点前24、18、12、0h加入相应浓度HMGB1

6、。重复试验3～4次。　　1.2.3体内试验分组6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠,随机分为生理盐水对照(NS)、24h高和低剂量HMGB1注射组［24h(H)或24h(L)］、48h高和低剂量HMGB1注射组［48h(H)或48h(L)］,每组每个时相点4只。动物禁食过夜,晨8∶00腹腔注射0.2mg/L或20mg/LHMGB1,或生理盐水,0.5mL/只,于20∶00再次腹腔注射0.2mg/L或20mg/LHMGB1,或生理盐水,0.5mL/只。于相应时相点,收集、分离、纯化腹腔巨噬细胞,方法同前,DMEM培

7、养液(100mL/LFCS)调整至3×109/L,部分用于检测巨噬细胞吞噬功能,部分用于检测巨噬细胞IA/E表达。　　1.2.4指标检测(1)巨噬细胞吞噬功能:用DMEM培养液(100mL/LFCS)调整收集的巨噬细胞至3×109/L,0.1mL/孔,孵育4h,弃上清,加0.72g/L中性红溶液0.1mL/孔,继续孵育30min,弃中性红,0.01mol/LPBS洗4遍,加细胞裂解液0.2mL/孔,37℃过夜。检测A540值。A540值大小用于反映巨噬细胞的吞噬能力强弱。(2)巨噬细胞IA/E表达:收集

8、培养或体内试验分离的腹腔巨噬细胞0.5×106～1.0×106,经抗FcγⅡ/Ⅲ受体抗体1μg处理。再加入FITC标记抗CD14及RPE标记抗IA/E或RPE标记同型对照,4℃避光孵育30min,洗涤后10g/L多聚甲醛重悬,固定。采用流式细胞仪配套的CellQuest软件进行分析检测,其中FITC、RPE分别设在FL1、FL2荧光通道上,在CD14/SSC上根据CD14+设